Биуретовый реактив как приготовить

Содержание

Биуретовый реактив как приготовить
Биуретовый метод
Определение общего белка по биуретовой реакции

Биуретовый реактив как приготовить

Лабораторная работа №6

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Принцип метода: метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди. Существуют две разновидности этого метода: при одной из них определяют от 2 до 10 мг белка в пробе, чувствительность другой (микрометода) — от 0,1 до 2 мг.

Реактивы:

1.Стандартный раствор белка, например сывороточного альбумина, содержащий 10 мг в 1 мл, раствор белка концентрации Х.

2.Биуретовый реактив: 0,15 гCuSО₄·5H₂О и 0,6 г NaKC₄H₄O₆·4H₂O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н₂О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-го раствора NaOH (свободного от Na₂CO₃), добавляют0,1 г KI и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в парафинированной или полиэтиленовой посуде.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр.

Ход работы

K 1 мл раствора, содержащего от 2 до 10 мг белка, добавляют 4 мл биуретового реактива. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего фотометрируют на при 540 нм. По полученным результатам строят калибровочный график зависимости оптической плотности раствора Д 540 от концентрации белка.

Содержание белка в исследуемом растворе рассчитывают по калибровочному графику. Определению мешает присутствие солей аммония.

Микроопределение белка по биуретовому методу

Реактивы:

1. Стандартный раствор белка, например сывороточного альбумина, содержащий 1 мг в 1 мл, раствор белка концентрации Х.

2. Биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта): 17,3 гцитрата натрия и 10 гNa₂CO₃ растворяют при подогревании в небольшом количестве воды. B раствор добавляюг1,73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл.

3. NaOH — 6 %-й раствор.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр.

Ход работы

K 2 мл раствора, содержащего 0,1—2 мг белка, добавляют 2 мл 6 %-го раствора NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 330 нм на спектрофотометре. Предварительно строят калибровочный график по стандартному раствору белка.

Источник

Биуретовый метод

Работа 59. Количественное определение белка

РАЗДЕЛ 6. ОБМЕН БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ

Контрольные вопросы

1. Биологические функции нуклеотидов и полинуклеотидов.

2. Строение нуклеотидов и полинуклеотидов.

3. Биосинтез пуриновых и пиримидиновых оснований.

4. Катаболизм пуриновых и пиримидиновых оснований.

5. Нарушение обмена пуриновых и пиримидиновых оснований.

Для количественного определения белков используют физические, химические и биологические методы.

Из физических методов простейшим является взвешивание чистого белка. Однако белки очень гигроскопичны, и полностью удалить из их состава воду очень трудно, поэтому этот способ применяют редко.

Наибольшее распространение из физических методов количественного определения белков получили три – рефрактометрический (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой области спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок), пикнографический метод (по плотности белковых растворов).

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простой химический метод определения — количественное определение общего или белкового (после осаждения белка и отделения его от растворимых азотсодержащих веществ) азота.

Самым распространенным методом количественного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности цветных реакций, развивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специфическим реагентом. Чтобы рассчитать концентрацию белка, строят калибровочный график.

Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической активности препарата, можно составить представление о содержании в нем белка, обладающего данной активностью. Этот метод не дает абсолютных результатов.

Биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.

Исследуемый раствор:стандартный раствор белка, содержащий 10 мг в 1 мл.

Реактивы: биуретовый реактив – 0,15 г CuSO₄ 5H₂O и 0,6 г NaKC₄H₄O₆·4H₂O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н₂О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ного раствора NaOH (свободного от Na₂CO₃), добавляют 0,1 г КI и доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке.

Оборудование:пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы с длиной светового пути 5 мм.

ХОД РАБОТЫ. В 4 сухие пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка. В три пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 2,5; 5,0; 7,5 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения калибровочной кривой. В 4-ю пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую необходимо определить.

В каждую пробирку добавляют по 2 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с длиной оптического пути 5 мм, пользуясь зеленым светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе используют биуретовый реактив.

Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка.

Источник

Определение общего белка по биуретовой реакции


	Биохимия: методы Определение креатинина сыворотки крови по реакции Яфф Определение общего белка по биуретовой реакции Подготовка экспериментального биоматериала Определение липидов сульфованилиновым реактивом Определение активности лактатдегидрогеназы Методы определения билирубина и его фракций.

Унифицированный метод определение общего белка по биуретовой реакции

Белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди(2), при этом образуются соединения, окрашенный в фиолетовый цвет (биуретовая реакция).

1. Натрия хлорид, ч.д.а или х.ч., 154 ммоль/л (изотонический раствор) 9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют водой и доводят до метки водой.

2. Натр едкий, ч.д.а. или х.ч., 0,2 моль /л: 8 г едкого натра помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют в воде и доводят до метки водой.

3. Калия йодид ч.д.а. или х.ч., 30 ммоль/л раствор йодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра;0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором NaOH до метки и растворяют.

Реактив стабилен в течении 2 нед. при хранении в посуде из темного стекла.

4. Калий-натрий виннокислый 4-водный(сегнетова соль) ч.д.а.

5. Меди сульфат 5-водный ч.д.а или х.ч.

6. Биуретовый реактив: 4,5 сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л растворе едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла.

7. Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5 раствора йодида калия. Раствор стабилен.

8. Калибровочный раствор альбумина (из человеческой сыворотки):100 г/л раствор альбумина в 154 ммоль/л растворе хлорида натрия.

Материал для исследования.

Опытная проба: к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин (и не позднее чем через 1 ч) измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостая проба: к 5 мл раствора биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 154 ммоль/л раствора NaCI , далее обрабатывают как опытную пробу.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика:

Из калибровочного раствора готовят рабочие растворы как указано в (Таблице №1) Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива ; через 30-60 мин измеряют на фотометре, как в опыте против холостой пробы. По полученным данным строят калибровочный график. Калибровочная кривая линейна до 100 г/л альбумина

НОРМАЛЬНЫЙ ВЕЛЕЧИНЫ: 65-85 г/л (6,5-8,5 г/100 мл)

Приготовление разведений для построения калибровочного графика

Стандартный раствор, мл

Концентрация белка г/л

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА

в биологическом материале

Определение общего белка в сыворотке крови

по биуретовой реакции

Определение общего белка по биуретовой реакции является на сегодняшний день самым распространенным методом определения общего белка в сыворотке крови.

Метод относительно дешев, прост, обладает хорошей воспроизводимостью и специфичностью, использование его позволяет выполнять исследование как на анализаторах (автоматических и полуавтоматических), так и на обычном фотометре.

Белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием комплексных соединений, окрашенных в фиолетовый цвет. По интенсивности окрашивания, которое пропорционально количеству белка, определяют содержание его в сыворотке крови.

Для определения общего белка крови по биуретовой реакции кровь желательно брать утром натощак.

1. Натрия хлорид, ч. д. а. или х. ч., 154 ммоль/л (изотонический раствор): 9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в воде и доводят до метки водой.

2. Натр едкий, ч. д. а. или х. ч., 0,2 моль/л: 8 г едкого натра помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют в воде и доводят до метки водой.

3. Калия йодид, ч. д. а. или х. ч., 30 ммоль/л раствор йодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра: 0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором едкого натра до метки и растворяют. Реактив стабилен в течение 2 недель при хранении в посуде из темного стекла.

4. Калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль) ч. д. а.

5. Меди сульфат 5-водный ч. д. а. или х. ч.

6. Биуретовый реактив: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла не более месяца.

7. Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5% раствора йодида калия. Реактив хранят в темном месте не более 2 недель.

8. Калибровочный раствор альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) — 100 г/л раствор альбумина в 154 ммоль/л растворе хлорида натрия: 1 г альбумина из человеческой или бычьей сыворотки растворяют в 6 — 7 мл 0,9% раствора хлорида натрия и доводят изотоническим раствором хлорида натрия до объема 10 мл; 1 мл стандартного раствора содержит 0,1 г белка.

Материал для исследования

Для анализа могут использоваться как сыворотка, так и плазма. При этом обычно получают сравнимые результаты, хотя, из-за присутствия фибриногена, уровень общего белка в плазме на 2–4 г/л выше, чем в сыворотке.

Определение содержания белка в сыворотке, полученной в вакуумных системах с разделяющим гелем и без него, дает сопоставимые результаты. Не было получено существенных различий в содержании белка в образцах крови, собранных в стеклянных или пластмассовых вакуумных системах.

Для исследования не следует использовать гемолизированную сыворотку, так как гемоглобин также является белком и будет вступать в биуретовую реакцию, что приведет к ложному завышению результатов анализа: присутствие гемоглобина приводит к завышению результатов на 3 % на каждый 1 г/л свободного гемоглобина в сыворотке.

Нежелательно использовать хилезную сыворотку, так как она из-за мутности будет оптически интерферировать с результатами определения, а следовательно приведет к ложному завышению результатов. Для устранения интерференции, вызванной значительной липемией применяют экстракцию диэтиловым эфиром. При незначительном присутствии липидов можно провести исследование, установив «бланк» по пробе больного, либо развести пробу изотоническим раствором хлорида натрия, а затем умножить результат на степень разведения.

Интерферирующее действие оказывает и билирубин при концентрации более 85 мкмоль/л. Поэтому в случае гипербилирубинемии также используют либо разведение сыворотки, либо установку «бланка» по пробе больного.

В ряде случаев в реакцию могут вмешиваться препараты, применяющиеся для лечения, особенно у тяжелых больных. Так, например, декстраны, используемые в качестве плазмозамещающих растворов, образуют комплекс с медью и тартратом в реакционной смеси и приводят к образованию рыхлого синего осадка. Степень вмешательства зависит от концентрации декстрана и состава биуретового реактива. При вводимых обычно количествах декстрана величина ошибки может составлять от 3 до 50 %. Полагают, что добавление глицерина в реактив или использование низкой концентрации NaOH способны предотвратить вмешательства декстрана в ход реакции. Присутствие в образце ионов аммония может способствовать образованию комплексов аммония с ионами меди, приводить к снижению концентрации ионов меди в реакционной среде, и, соответственно, к снижению скорости реакции и ложноотрицательным результатам. В редких случаях вмешательство лекарственных препаратов, находящихся в сыворотке таково, что при взаимодействии биуретового реактива с сывороткой наблюдается либо развитие окраски, отличной от фиолетовой, либо появление мутности. Оценить количество белка в такой сыворотке невозможно.

Содержание общего белка устойчиво в сыворотке и плазме в течение 1 недели при комнатной температуре и, по крайней мере, 2 месяца при -20 °C.

Ход определения общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции

к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены.

Через 30 минут (и не позднее чем через час) измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500 — 560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия, далее обрабатывают как опытную пробу.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика:

из калибровочного раствора готовят рабочие растворы как указано ниже.

Источник