Для исследования необходимо приготовить стандартный универсальный реагент

Определение группы крови и резус- фактора

Лабораторное определение группы крови и резус-фактора проводится перед каждым переливанием. Самым распространённым методом определения группы крови является определение по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам. Определение группы крови основано на реакции агглютинации, которая происходит при соединении исследуемой крови с сыворотками известных групп.

Манипуляция проводится с соблюдением всех правил безопасной работы с кровью, в светлом помещении, с температурой в нем от _________ до _____________ºC.

— планшеты с маркировкой;

Определите последовательность действий при определении группы крови

1. Отдельными стеклянными палочками смешать сыворотку и кровь в каждой ячейке.

Поставить песочные часы на 5 минут.

o Во второй ряд с маркировкой « вторая серия» нанести стандартные сыворотки І, ІІ и ІІІ групп второй серии.

o Наблюдать за наступлением реакции агглютинации, покачивая планшетку, но так, чтобы не смешивались капли разных групп.

o На планшет в первый ряд с маркировкой «первая серия» нанести стандартные сыворотки І, ІІ и ІІІ групп. Капли нанести большие, в диаметре равные 1 см.

o В те капли, где агглютинация произошла, добавить по капле физраствора, чтобы отличить истинную агглютинацию от ложной.

o Исследуемую кровь поместить рядом с каждой из 6 капель сыворотки. Капли нанести маленькие (отношение сыворотки и крови 10 :1.

o После введения физраствора через 5 минут оценить конечный результат.

Оцените конечный результат при определении группы крови

Определение резус-фактора

Данное исследование проводится перед каждым переливанием. Существует несколько методов определения резус-фактора, чаще проводится метод с использованием универсального реагента антирезус Rh0.

Для исследования необходимо приготовить:

• Стандартный универсальный реагент;
• _______________________________________________________________________;
• _______________________________________________________________________;
• _______________________________________________________________________;
• _______________________________________________________________________.

Источник

Определение резус фактора экспресс методом с помощью стандартного универсального реагента без подогрева в пробирке

Для определения резус-фактора может быть использована свежая не свернувшаяся кровь, взятая из пальца непосредственно перед исследованием, или консервированная, без всякой предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после образования сгустка и отстаивания сыворотки.

— 1мл стандартного универсального реагента (антирезусная сыворотка группы AB(IV)+33% раствор полиглюкина);

-1мл исследуемой крови(эритроцитов)

На дно пробирки внести 1 каплю стандартного универсального реагента и 1 каплю исследуемой крови (или эритроцитов).

Содержимое пробирки перемешать встряхиванием и затем медленно поворачивать, наклоняя пробирку почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по её стенкам. после 3-минутного покачивания ,

для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавить 2-3мл физиологического раствора хлористого натрия и перемешать, не взбалтывая, путём 2-3-х кратного перевёртывания пробирки. Оценку производить визуально.

Резус-(+) -наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветлённой жидкости .

Резус-(-) -отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная жидкость).

Определение резус-фактора с помощью моноклонального реагента (цоликлон анти-d , анти-d супер).

Цоликлон анти-D супер выпускается во флаконах по 2,5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). Срок хранения — 1 год в холодильнике при t 2

8 °С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение месяца в закрытом виде

Наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет.

Рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешивают кровь с реагентом.

Реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 сек, четко выраженная агглютинация наступает через 30-60 сек.

Результаты реакции считывают через 3 мин.

Тарелку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30 сек, что позволяет за это время развиться более полной крупнолепестковой агглютинации.

Метод агглютинации на чашках Петри.

-две серии стандартных сывороток антирезус всех групп системы АВО;

-контрольные образцы резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов:

-водяная баня с постоянной температурой 46-48 С°

В чашку Петри наносят по 2 капли антирезусной сыворотки, слева — одной серии, справа — другой в 3 ряда для 3 исследований. В каждую серию прибавляют по 1капле эритроцитов (1.исследуемые, 2.контрольные Rh-положительные и 3.контрольные Rh-отрицательные). После смешивания (стеклянными палочками) сывороток в каждой точке с добавленными эритроцитами чашку помещают в водяную баню при t° 46—48° на 7—10 мин, после чего рассматривают в проходящем свете.

Наличие агглютинации свидетельствует о положительном результате, отсутствие ее — об отрицательном. Для контроля в этом методе используют заведомо Rh-отрицательные и Rh-положительные эритроциты.

Метод агглютинации с 10% желатином:

Реакция конглютинации с желатиной обычно проводится в пробирках емкостью 8—10 мл. В штатив устанавливают 2 ряда пробирок для двух различных серий стандартной сыворотки. В контрольные пробирки каждого ряда вводят по 1 капле стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов, в остальные пары пробирок — исследуемые эритроциты. Исследование можно проводить как с отмытыми, так и с неотмытыми эритроцитами.

Затем в каждую пробирку добавляют по одной капле подогретой до разжижения желатины (10% раствор) и по одной капле стандартной сыворотки. Содержимое пробирок смешивают путем встряхивания и помещают в водяную баню при t° 46—48° на 5 мин., по истечении которых в каждую пробирку доливают 5—8 мл подогретого до t° 46—48° физиологического раствора NaCl и рассматривают на свет, определяя наличие или отсутствие агглютинации (рис. 2).

Метод агглютинации в солевой среде.

При исследовании сывороткой, содержащей полные антитела, применяют метод агглютинации в солевой среде в маленьких пробирках (высотой 2—2,5 см, диаметром 0,5 — 0,6 см).

В штатив устанавливают 2 ряда пробирок (по количеству исследуемых образцов и по 2 для контроля), в которые вводится по 2 капли стандартной сыворотки и по 1 капле 2% взвеси эритроцитов, предварительно дважды отмытых физиологическим раствором NaCl.

Содержимое пробирок встряхивают и помещают в термостат при t° 37° на 1 час.

О резус-принадлежности судят по форме осадка, который рассматривают через лупу с 5—7-кратным увеличением над источником света, закрытым матовым стеклом. Результаты учитывают в зависимости от наличия или отсутствия агглютинации в исследуемых эритроцитах после проверки контрольных образцов.

Источник

Определение резус-фактора экспресс-методом

Приводим пошаговое описание методики определения резус-фактора экспресс-методом с помощью универсального реагента антирезус Rh₀(D), содержащего неполные поликлональные IgG анти-D антитела, в пробирке без подогрева. Публикуем подробное руководство по постановке реакции конглютинации с желатином с применением стандартного реагента Rh₀(D) или цоликлона Анти-D. Доказываем преимущества использования цоликлонов Анти-D-супер и Анти-D по сравнению с универсальным реагентом.

В состав стандартного универсального реагента антирезус Rh₀(D) входят поликлональные неполные IgG анти-D антитела. Для подтверждения достоверности определения резус-фактора крови донора экспресс-методом необходимо провести проверку контрольных образцов стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. При проведении контрольного исследования используйте тест-эритроциты Rh+ группы 0 или совпадающей по системе AB0 группы и одногруппные по AB0 тест-эритроциты Rh-.

Методика постановки реакции в пробирке без подогрева

1. Внесите на дно пробирки одну каплю реагента антирезус Rh₀(D).

2. Добавьте к содержимому пробирки одну каплю анализируемых эритроцитов.

3. Встряхните пробирку для перемешивания жидкостей.

4. Наклоните пробирку практически до горизонтального положения и с небольшой скоростью поворачивайте вокруг вертикальной оси не менее трех минут. Рассредоточение эритроцитов по стенкам способствует более выраженным результатам реакции.

5. Добавьте 2 – 3 мл изотонического раствора NaCl и 2 – 3 раза переверните пробирку без взбалтывания. Хлорид натрия исключает проявление неспецифической агглютинации.

6. Оцените результат реакции визуально. Выраженные агглютинаты на фоне прозрачной жидкости говорят о наличии антигена D, равномерно окрашенная жидкость без агрегации эритроцитов – свидетельство резус-отрицательной крови.

Постановка реакции конглютинации с желатином

Реакция проходит с использованием стандартного реагента антирезус Rh₀(D) или цоликлона Анти-D.

1. Внесите в пробирку приблизительно 0,05 мл (одну каплю) анализируемой крови или 50 % взвеси эритроцитов в сыворотке.

2. Подогрейте 10 % раствор желатина до жидкого состояния.

3. Добавьте к исследуемому образцу крови 0,1 мл (две капли) желатина.

4. Внесите 0,1 мл (две капли) реагента антирезус Rh₀(D) или цоликлона Анти-D.

5. Перемешайте содержимое.

6. Подогрейте пробирку в водяной бане при 37 °C в течение 10 минут.

7. Долейте 5 – 8 мл раствора NaCl.

8. Перемешайте жидкости, осторожно перевернув пробирку 1 – 2 раза.

9. Проведите оценку результата реакции невооруженным глазом, допускается использование лупы.

Явно выраженные агрегаты различного размера на фоне прозрачного раствора свидетельствуют об обнаружении антигена D, равномерно окрашенная жидкость без наличия агглютинатов – признак отсутствия агглютиногена.

10. Подтвердите достоверность исследования контрольным определением.

При неадекватных результатах контрольного исследования повторите определение резус-фактора экспресс-методом с заменой типирующего реагента и/или желатина. В случае мелкозернистой агглютинации проведите дополнительное исследование эритроцитов в непрямой реакции Кумбса.

Сравнение различных методов определения резус-фактора

С целью выбора оптимального метода типирования крови специалисты в области трансфузиологии провели сравнительную оценку эффективности применения цоликлонов Анти-D-супер, Анти-D двух разных серий и универсального реагента антирезус Rh₀(D) для определения резус-фактора экспресс-методом в пробирке без подогрева (Шевченко, Ю.Л. Безопасное переливание крови/Ю.Л. Шевченко, Е.Б. Жибурт. — СПб.: Питер, 2000. — 308 с.). При сравнении методов анализа учитывали такие критерии, как скорость и специфичность реакции, выраженность агглютинации, выявление слабых форм антигена D u .

При проведении сравнения анализировали 3778 образцов крови доноров. При первичном определении выявили 418 (11,1 %) резус-отрицательных образцов, из которых на втором этапе исследования 42 (1,1 %) образца отнесли к резус-положительным ввиду обнаружения фенотипа D-C+.

При сравнении анализа на наличие антигена D с использованием Анти-D-супер и Rh₀(D) выявили значительные преимущества применения цоликлона Анти-D-супер: высокую скорость наступления реакции, выраженный характер агглютинации, возможность проведения исследования на плоскости. Результаты сравнения методов приведены в Таблице № 1.

Таблица № 1. Сравнения результатов типирования крови доноров с помощью цоликлона Анти-D-супер и универсального реагента антирезус Rh₀(D).

Параметр сравнения	Цоликлон Анти-D-супер	Универсальный реагент антирезус Rh0(D)
Скорость реакции	8 – 10 секунд	3 – 4 минуты
Выраженность агглютинации (от + до ++++)	++++	+++ и ++++
Специфичность	да	да

418 резус-отрицательных образцов крови доноров дополнительно анализировали на наличие антигена D с помощью универсального реагента Rh₀(D) в пробирке без подогрева и цоликлона Анти-D в желатиновом тесте. По итогам второго этапа исследования, в трех образцах эритроцитов (0,08 %) выявили слабый антиген D u . Цоликлон Анти-D продемонстрировал более высокую достоверность обнаружения слабых форм антигена D ввиду абсолютной специфичности и высокого титра (1:512) антител класса IgG по сравнению с универсальным реагентом антирезус Rh₀(D), использование которого основано на усилении действия неполных антител полиглюкином, что может вызывать неспецифическую агглютинацию и затруднить трактовку результатов реакции.

Источник