Фиксатор для мазков крови приготовить

Приготовление и фиксация мазков крови

Мазки крови делают на предметных стеклах с помощью более узкого шлифованного предметного стекла.

1. С предметных стекол, бывших в употреблении и соприкасавшихся с иммерсионным маслом, последнее удаляют сухой тряпкой или бензином. Затем стекла кипятят без мыла и соды в течение 15—20 мин, промывают чистой водой и погружают на 1 ч в насыщенный раствор двухромовокислого калия в серной кислоте. Обработанные таким образом стекла промывают в течение не менее 1 ч под струей водопроводной воды и насухо вытирают чистым поло­тенцем.

2. При отсутствии двухромовокислого калия и серной кислоты стекла, бывшие в употреблении, кладут в мыльный раствор и выдерживают в нем 8—10 ч, а затем в том же растворе кипятят их 5—10 мин.

От более длительного кипячения стекла делаются мутными.

После кипячения стекла вынимают и тщательно промывают под струей водопроводной воды, а затем насухо вытирают.

3. Стекла, не бывшие в употреблении, промывают в горячей воде и насухо вытирают. Хранят стекла в стеклянной широкогорлой банке с крышкой.

Взяв предметное стекло за длинные края, прикасаются его поверхностью (отступя 0,5—1 см от узкого края) к капле крови (но не к коже). Предметное стекло держат на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставляют шлифованное стекло узким краем к стеклу с кровью слева от капли под углом 45° и продвигают его вправо до соприкосновения с кровью.

Выжидают, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением ведут его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерена так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1—1,5 см до его края. Нельзя прекращать размазывание и отнимать стекло раньше, чем капля будет исчерпана. Нельзя также сильно нажимать на стекло, так как многие клетки могут оказаться поврежденными. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается «метелочкой».

Густо-розовые и красноватые мазки непригодны для счета, так как они слишком толсты и клеточные элементы при этом дифференцировать невозможно. После приготовления мазки быстро сушат на воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток.

На высушенном мазке уголком предметного стекла или карандашом (только не химическим) пишут фамилию, инициалы больного, дату. При необходимости переслать мазок с консультационной целью в другой город мазок рекомендуется делать на хорошо отмытой использованной рентгеновской пленке, нарезанной по размеру предметного стекла.

Такие мазки можно пересылать в письмах.

Симптом крошковатости мазка крови.

При заболеваниях, протекающих с повышенным содержанием фибриногена в крови, мазок, сделанный на предметном стекле, имеет крошковатый характер. На этот простой, и доступный признак рекомендуется обратить особое внимание при взятии крови.

Обработка мазков фиксирующими жидкостями, придающими форменным элементам стойкость по отношению к содержащейся в красках воде, которая без фиксации мазков гемолизирует эритроциты и изменяет строение лейкоцитов. Кроме того, фиксация, вызывая коагуляцию белка, прикрепляет препарат к стеклу.

Посуда и аппаратура.

2. Специальная посуда для фиксации или стаканы, обрезанные до высоты 6—6,5 см.

3. Штатив для сушки мазков на воздухе.

4. Предметные стекла.

Химически чистый метиловый спирт (метанол) или 96° этиловый спирт, или денатурированный спирт, или смесь Никифорова, состоящая из равных количеств этилового спирта и серного эфира.

Лучшим фиксатором является метиловый спирт.

Высохшие на воздухе мазки крови, сложенные попарно (мазками наружу), опускают пинцетом в специальную посуду для фиксации или в обыкновенные стеклянные стаканы, обрезанные до 6—6,5 см и наполненные до определенной высоты фиксирующей жидкостью. В последнем случае для обеспечения свободного соприкосновения намазанных сторон препаратов с фиксатором сверху, между попарно сложенными мазками, прокладывают предметные стекла, опирающиеся своими ребрами на верхнюю часть стакана. В метиловом спирте мазки выдерживают не менее 5 мин, а в этиловом и денатурированном спирте и смеси Никифорова — не менее 30 мин.

По окончании срока фиксации препараты вынимают пинцетом, сушат на воздухе или ополаскивают в банке с нейтрализованной дистиллированной водой и укладывают мазками кверху на стеклянный мостик для окраски.

Фиксация мазков по Яхонтовой.

Повышение качества фиксации этиловым спиртом за счет предварительной обработки его цитратом и оксалатом натрия.

Посуда и аппаратура.

1. Цилиндры емкостью 100 мл.

2. Пипетки, стеклянные палочки для размешивания.

5. Специаль­ная посуда для фиксации или стаканы, обрезанные до высоты 6—6,5 см.

6. Штатив для высушивания мазков на воздухе.

Готовят 2 реактива.

1. В цилиндр емкостью 100 мл вносят 1,5 г цитрата натрия, приливают 1,5 мл дистиллированной воды, размешивают стеклянной палочкой и для ускорения растворения помещают цилиндр в горячую водяную баню. В полученный слегка мутноватый раствор приливают этиловый спирт до объема 100 мл и тщательно, в течение 5—8 мин, размешивают. При размешивании на дне цилиндра образуется клейкое белое вещество, тянущееся за палочкой.

Раствор оставляют в покое на сутки для отстаивания.

2. Реактив готовят так же, как и предыдущий, но вместо цитрата натрия берут оксалат натрия.

Прозрачные реактивы 1 и 2 через сутки после их приготовления сливают в равных количествах и в этой смеси фиксируют сухие мазки крови в течение 20—30 с, после чего их подсушивают на воздухе (можно и не сушить!) и окрашивают.

Если при окраске эритроциты получаются не бледно-розовые, а серовато-розовые, то прибавляют раствор цитрата натрия в большем количестве. Качество окраски при такой фиксации получается хорошее, поэтому при отсутствии метилового спирта может быть применен описанный выше фиксатор.

Фиксация мазков парами фенола (по Сюткину).

Получение хорошего качества фиксации мазков при отсутствии спирта.

Посуда и аппаратура.

2. Стеклянный мостик для мазков.

1. Кристаллический фенол.

2. Дистиллированная вода.

В эксикаторе заменяют фарфоровую подставку на стеклянный мостик для мазков. Притираемые поверхности эксикатора и его крышки смазывают вазелином. На дно эксикатора наливают жидкий фенол (90 весовых частей кристаллического фенола и 10 весовых частей дистиллированной воды) из расчета 100 мл на 1,4 л объема эксикатора. В близи эксикатора на стене вешают термометр. Приготовленные обычным способом сухие мазки крови помещают в эксикатор на мостике в один ряд намазанной поверхностью вниз.

Для сохранения формы эритроцитов, лейкоцитов и дифференцированной окраски зернистости лейкоцитов воздействие на мазки крови паров фенола должно продолжаться в зависимости от комнатной температуры строго определенное время: при температуре 16—18° — 20 мин, при 19—21°—10 мин, при 22—24° — 5 мин, при 25—27° — 3 мин.

По истечении этого времени мазки вынимают, раскладывают на столе намазанной поверхностью кверху. Время выветривания мазков должно быть не менее времени фиксации. Время фиксации мазков крови парами фенола может быть сокращено до 1ч-1ч30мин в условиях термостата при 28—30°.

Время освобождения от паров фенола при воздействии его в течение 10— 20 мин может быть в срочных случаях сокращено до 5 мин путем подогревания при 37° в термостате, сушильном шкафу, на батареях водяного отопления или выветриванием настольным электровентилятором.

Если применяют жидкий фенол, качество которого бывает различным, то время фиксации может не совпасть с указанным выше.

В этом случае во избежание ошибок производят пробную фиксацию нескольких мазков в течение 3; 5; 10; 15; 20; 25 мин.

После окраски мазков отбирают те из них, в которых хорошо выражена нейтрофильная зернистость и отсутствует гемолиз эритроцитов. То же проделывают при возможных колебаниях комнатной температуры.

По отобранным мазкам составляют таблицу времени фиксации парами фенола в зависимости от температуры в комнате.

Недостаточная фиксация мазков дает слабую окраску нейтрофильной зернистости, а недостаточное освобождение мазков от паров фенола ведет к гемолизу эритроцитов при окраске или окрашиванию мазка в красный цвет.

Приготовление и окраска толстой капли;

Использование большего­ объема крови с целью улучшения условий обнаружения в крови малярийных плазмодий, спирохет возвратного тифа, эозинофилов и полихроматофилов.

Посуда и аппаратура.

1. Предметные стекла.

2. Мостик для окраски с кюветой.

3. Штатив для сушки мазков.

1. Краска Романовского.

2. Дистиллированная вода.

Приготовляют обычный мазок крови и на толстые места его наносят отдельно две большие капли крови. Каждую каплю концом иглы или углом другого стекла размазывают до величины двух- или трехкопеечной монеты и сушат на воздухе.

Мазок до нанесения толстых капель и после не фиксируют, а наливают на него на несколько минут дистиллированную воду для извлечения гемоглобина. Окрашенную гемоглобином воду затем осторожно сливают и на препарат наливают разведенную, как обычно, краску Романовского на 20—30 мин. После окраски препарат осторожно промывают водой, чтобы не смыть каплю, и высушивают на воздухе.

Больший объем крови, чем в мазках, и гемолиз эритроцитов позволяют легче обнаружить в крови малярийные плазмодии, спирохеты возвратного тифа, а также эозинофилы и полихроматофилы.

При хорошей фиксации и окраске любым из приведенных выше способов ядра лейкоцитов окрашиваются в вишнево-красный цвет с хорошо видимой структурой хроматина,

ядрышки — в синевато-голубоватый или в светло-фиолетовый,

цитоплазма нейтрофилов — в светло-розовый,

лимфоцитов — в чистый сине-голубой,

моноцитов — в серо-голубой или дымчатый,

зернистость нейтрофильная — в красновато-фиолетовый,

эозинофильная — в оранжево-красный,

базофильная — в темно-фиолетовый или темно-серый,

азурофильная — в вишнево-красный,

эритроциты — в бледно-розовый цвет.

Приведенные методы окраски дают возможность дифференцировать вид клеток, особенности структуры их ядер и цитоплазмы и патологические изменения в них.

Окраска патологической (токсигенной) зернистости нейтрофилов по Шмелеву.

Окрашивание патологической зернистости нейтрофилов в кислых растворах азура II и эозина

(начиная с рН 5,4). При этом в норме зернистость не выявляется и цитоплазма нейтрофилов окрашивается в гомогенно-розовый цвет.

Посуда и аппаратура.

1. Специальная посуда для фиксации или стаканы, обрезанные до высоты 6—6,5 см.

3. Остальное см. «Окраска по Романовскому».

1. Дифосфат натрия.

2. Монофосфат калия.

3. Краска азур II.

4. Водорастворимый желтоватый эозин.

5. Дистиллированная вода.

6. Фильтровальная бумага.

Приготовление буферного раствора.

11,876 г высушенного в теплом месте в течение 5 сут двуводиого дифосфата натрия (Na2HP04*2H20) растворяют в 1 л дистиллированной воды;

9,078 г монофосфата калия (КН2Р04) также растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Для получения буферной смеси рН 5,4 0,4 мл полученного раствора дифосфата натрия смешивают с 9,6 мл раствора монофосфата калия.

Краситель готовят из 0,1% водного раствора азура II и 0,1% водного раствора водорастворимого желтоватого эозина. Смешивают 10 мл фосфатной буферной смеси с 2,5 мл 0,1% водного раствора азура II и 1,5 мл 0,1% водного раствора эозина.

Мазок фиксируют в течение 4 мин в метиловом спирте, затем окрашивают в течение часа азуром II — эозином в фосфатной буферной смеси. После этого краску смывают дистиллированной водой и мазок просушивают фильтровальной бумагой.

При правильной окраске наряду с нейтрофилами, цитоплазма которых содержит фиолетовые зерна (патологическая зернистость), встречаются клетки с совершенно гомогенной розовой цитоплазмой. При слишком кислой смеси лейкоциты почти не окрашиваются.

При щелочной среде зернистость выявляется во всех нейтрофилах.

В этих случаях нужно немного увеличить количество или дифосфата натрия, или монофосфата калия. Индикатором точности реакции буферной смеси служат мазки крови.

Окраска патологической (токсигенной) зернистости по Фреифельд.

Применение основной краски — карбол-фуксин-метиленового синего.

Посуда и аппаратура см. «Окраска по Романовскому» и водяная баня.

1. 1 г основного фуксина растворяют при слабом нагревании в 15 г 96° этилового спирта, охлаждают и к спиртовому раствору добавляют 100 мл 5% раствора карболовой кислоты.

2. 1% водный раствор метиленового синего.

Оба красителя можно хранить в отдельности практически неограниченное время.

Рабочую смесь готовят непосредственно перед окраской, так как она непригодна для хранения.

К 20 мл водопроводной воды приливают 7 капель первой краски, смешивают, прибавляют 5 капель второй краски и снова смешивают.

Мазки крови, фиксированные 3 мин в метиловом спирте, красят 1 час рабочей смесью красителя, а затем краситель смывают водой и мазки высушивают.

Препарат, уже окрашенный по Романовскому, может быть окрашен этим способом без предварительного обесцвечивания.

В цитоплазме лейкоцитов выявляется синеватая сеточка со всеми переходами к образованию крупных комочков. Количество клеток с патологической зернистостью в цитоплазме выражают в процентном отношении; например, количество всех нейтрофилов 75%, из них с патологической зернистостью 48%

Наличие в цитоплазме нейтрофилов патологической зернистости имеет большое значение для оценки состояния больного при инфекционных процессах, при сепсисе, новообразованиях, интоксикациях и других заболеваниях.

Увеличение количества нейтрофилов с патологической зернистостью указывает на тяжесть процесса, уменьшение их при повторных исследованиях крови — на благоприятное течение болезни. При острых инфекциях патологическая зернистость появляется не ранее 4—5-го дня от начала заболевания и часто не идет параллельно с ядерным сдвигом, который обычно появляется в начале болезни.

Окраска для выявления базофильной пунктации эритроцитов по Фреифельд

Базофильная зернистость эритроцитов хорошо воспринимает щелочной раствор метиленового синего.

Посуда и аппаратура см.

«Окраска по Романовскому».

1. 1% водный раствор метиленового синего.

2. Метиловый спирт.

Мазок фиксируют в течение 3 мин в метиловом спирте, а затем окрашивают в течение часа раствором метиленового синего (5 капель 1% раствора на 20 мл водопроводной воды).

Краску смывают водой и мазок высушивают.

Базофильную пунктацию можно обнаружить и в мазках крови, окрашенных обычными способами по Романовскому, Паппенгейму—Крюкову и др.

В этом случае она приобретает фиолетово-синий цвет.

Обычно сосчитывают 10 000 эритроцитов и отмечают количество эритроцитов с базофильной пунктацией. Лучше считать 1 000 000 эритроцитов, а ответ давать в пересчете на 10 000.

У здоровых людей количество эритроцитов с базофильной пунктацией колеблется от 0 до 3—4 на 10 000 эритроцитов.

Число эритроцитов с базофильной пунктацией увеличивается в крови плода, при некоторых анемиях, отравлении тяжелыми металлами (свинец, висмут, цинк, ртуть). Однако этот симптом не является специфичным для какого-либо заболевания.

Увеличение количества эритроцитов с базофильной пунктацией не всегда наблюдается даже при свинцовом отравлении.

Источник