Как приготовить агарозный гель для электрофореза
Заливка агарозного геля
- взвесить необходимое количество агарозы (после взвешивания весы на «0» не сбрасывать);
- долить буфер до нужного объёма (измерять по весу; объём, занятый агарозой вы учитываете, не сбрасывая на «0» в п.1);
- сбросить весы на «0» (но не выключать, они ещё понадобятся в п.5);
- агарозу довести до кипения, кипятить 30-60» (вынимать из микроволновой печи осторожно — может резко вскипеть);
- банку на весы, довести вес до «0» добавляя H 2 O mQ (осторожно — может резко вскипеть);
- остудить до 50-60 o С (можно спокойно держать банку в руках), лучше с покачиванием;
- ( дополнительно — для сборных плашек ) «пролить» спейсеры, дать агарозе застыть в течение 2-4′;
- залить плашки, дать агарозе застыть в течение 0.5-1h;
- либо использовать плашки в течение
2h, либо не вынимая гребёнку завернуть в SaranWrap (SaranWrap накладывать на гребёнку свободно, без натяжения, иначе он её «перекосит»), и убрать в холодильник (можно хранить в течение месяца; для 1% гелей вынимать гребенку из геля можно лишь непосредственно перед применением.).
Расход геля для различных типов плашек
Меньший предел определяется (в основном) диффузией полосы в геле. Т.е. в гелях с низкой концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы не четкие. Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более длинные молекулы можно эффективно разделить. Разделение суперскрученных и кольцевых молекул К сожалению относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий фореза: % геля, скорость фореза (в частности, это означает, что нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул). Приведенная таблица дает некоторое представление о соотношении подвижностей при умеренной ( 6V/cm) скорости фореза (в скобках — при более быстром разгоне):
В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию EtBr. На 1% агарозном форезе ssDNA бежит чуть быстрее ( 10%), чем dsDNA того же размера. ssDNA окрашивается EtBr заметно слабее, чем ds (разница в 4-5 раз). Tо есть, чтобы полосы имели одинаковую интенсивность окраски, требуется взять в 5 раз больше ssDNA. Чтобы разделить цепи, нужно либо непосредственно перед форезом прогреть 1′ 100 o C, либо добавить к образцу NaOH до 0.1 М, 5-10′ (NT или 37 o C); При оценке напряженности поля для горизонтального фореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами. На рисунке показана схема форезов, при разном напряжении. Форезы проводились разное время, так, чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля. Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для высококачественных или препаративных форезов: 2V/cm(можно меньше для ON форезов). Для аналитических форезов приемлемое качество сохраняется до DNA особенно легко теряет EtBr при повышенной температуре (что обычно случается, если гонять форезы при высоком напряжении). EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер. Количество DNA, которое можно наносить на дорожку Нижний предел определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то не стоит надеяться увидеть 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере 0.005-0.02%) могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. По нашему опыту, элюция фрагмента в РEG вместе с любым из этих красителей не оказывает заметного влияния на меченье, лигирование и трансформацию. 0.1mM) совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV. 0.01-0.05%) наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV. Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле. Обычно приводимые в методиках 0.025% для бромфенолового синего и ксиленцианола (в 1х буфере) по нашему мнению слишком большое количество. Лучше иметь на столе * буфера с различными красителями. Смотри также: | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 | |
| Дополнения, комментарии, вопросы Для оптимального разделения не очень больших фрагментов, можно пользоваться буфером для внесения по рецепту, указанному в каталоге MBI Fermentas: 6x Orange Loading Dye Solution (#R0631) При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. Такой подход позволяет оптимизировать рабочее напряжение, а, соответственно, и разделение. И еще — я человек в мол.биологии непросвещенный, а потому да простят меня профессионалы, если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки. Люди, хелп! Если кто-нибудь знает что-то про технологию внесения биополимеров в гель под названием Shark Teeth, напишите, пожалуйста! А почему бы заодно не добавить в текст, что рабочая концентрация бромистого этидия, например, 0,5 мкг/мл и что его можно добавлять прямо в гель, что гель с добавленным в него EthBr спокойно стоит ночь под электродным буфером без заметного вымывания из него краски? Полезные, вобшем-то факты, хоть и мелкие, но, с моей точки зрения, вполне не лишние. Акульи зубы — не гель. а гребенка в виде этих самых зубок. Втыкается в гель, и не вынимается, а образец наносится тонким-тонким носом в дырки между зубами. См. инструкцию к Макрофору. Только это не про агарозный форез. 2Re: что это гребенка такая, я знаю. Только сейчас вижу, что по формулировке моего вопроса кажется, будто это гель так называется:) Все, спасибо, уже поздно:) Только по моим данным, это имено про форез. Не знаю уж, про агарозный или ПААГ, по-моему, в данном случае не суть важно Народ, а какова длина волны для визуализации ПЦР-фрагментов? Лучше читать последнюю. народ, а как точно называется маркер мол веса (лестница)? и куда, как ее наносить? а почему в гел Этьбромид а не GelStar ? GelGreen ? GelRed ? SYBRSafe ? а почему ТБЕ ТАЕ а не SB (sodium borate) ? а почему UV а не Blue ( Safe Imager , Dark Reader , FlashGel) А ПОКОЧАНУ )))) ответ от радио Molbiol — Не выпендрюйся Василий Иваныч-слушай свои «Валенки» 1: Biotechniques. 2004 Feb;36(2):214-6. Links Erratum in: * Brody JR, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA. PMID: 14989083 [PubMed — indexed for MEDLINE] All: 1 1: Electrophoresis. 2001 Mar;22(5):814-28.Click here to read Links Clare Chemical Research, Inc, Denver, CO 80206, USA. mseville@clarechemical.com The Dark Reader optical system (Clare Chemical Research, Denver, CO, USA) uses relatively low intensity broad-band visible blue light in combination with broad-band optical filters to detect fluorescence with a level of sensitivity that often surpasses that of UV transilluminators and can rival that of laser-based scanners. Applications of DR (Clare Chemical Research) devices include the detection of DNA and SYBR-stained protein samples following, and also during, electrophoresis. Unlike laser-based imaging systems, the fluorescence is directly visible to the user as well as being fully compatible with charge-coupled device (CCD) and Polaroid camera-based detection and imaging. Additionally, the DR optical system functions well in multicolor fluorophor environments. Because the Dark Reader does not emit any UV light, the extent of DNA damage incurred when visualizing DNA samples is drastically reduced compared to the damage produced by a UV device and this can have a significant benefit on downstream cloning protocols. Furthermore, dye photobleaching is minimal, extending the length of time that a fluorescent sample is visible. The inherent flexibility of the DR optical system allows many different configurations of the Dark Reader to be constructed such as transilluminators, hand lamps and integrated transilluminator-electrophoresis units. PMID: 11332748 [PubMed — indexed for MEDLINE] Today’s Featured Review Nucleic Acid dye Until recently Sybr green had been our labs nucleic stain of choice. We have, however, recently migrated to Biotium’s GelRed. GelRed is a newer nucleic acid gel stain that is safer and more temperature stable than other dyes. GelRed is safer because it is non mutagenic and is diluted in water. It is more thermostable than Sybr dyes because it does not degrade with repeated freeze-thaws or long storage (couple months at RT) and can be stored at room temperature, and sensitivity seems to at least equal if not exceed Sybr green when visualized with UV transilluminator. The dye is used similarly to Sybr dyes with staining (available at 10,000X ) or direct sample additions. The technology is not particularly ground breaking or new but the safety profile of this product makes it a viable alternative to potentially more dangerous dyes. Review by Vitelli Using GelGreen ‘In-Gel’ Save even more Time. GelGreen Safety FlashGel™ DNA System The FlashGel System is the fastest way to separate DNA and the only way to watch DNA migration as it happens. This revolutionary new tool separates DNA in 2 – 7 minutes. Monitor gel runs right at the bench, without UV light. The highly sensitive system allows a 5X reduction in DNA levels – saving both time and money. * Get results in 5 minutes or less. The FlashGel System consists of enclosed, disposable, precast agarose gel cassettes and a combination electrophoresis and transilluminator unit. * FlashGel Cassettes contain precast, prestained agarose gels and buffer – no need for gel preparation, buffer addition or gel staining. See FlashGel Run! это все называется «ДНК технология» — не путайте с одноименной фирмой всем привет. Здравствуйте! «. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. « а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации. Скорее всего малая концентрация? Спасибо —Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно —. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. « —а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит. Вроде красители в агарозе мигрируют на одно и тоже Rf не зависимо от процентности. А вот фрагменты сильно зависимо от процентности. Берете 2 маркера 100b и 1000b и в разных процентностях агарозы гоните с красителями и очень хорошо определяете, что с чем бежит. 3 процентный агароз вам уже трудно будет растворить. Я так дУмаю-у Мне кажется это лишняя работа элюировать ДНК из геля для последующей амплификации. Срез геля в воду, заморозить-разморозить и 1-2 мкл на ПЦР. Вы реамплифицируете кг. Спасибо, попробую на следующей неделе. А что если уже выделил из геля с помощью QG и при исходнике с приблизительной количеством 50 нг получил 40 мкг в 40 мкл. На форезе 1,2% в 10 мкл пробы ясен перец ничего не видно, агароза супер. Поставил на ПЦР, отправил 20 мкл в смесь, жду результатов. Сколько приблизительно может быть продукта? Спасибо Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка?? 1% агарозу (в 2% линейная ДНК идет очень близко к суперскрученной, в 0.7% — близко к релаксированной). Если требуется проконтролировать циклизацию 3kbp фрагмента, то надо использовать 2% агарозу. если у Вас не нарабатывается большое кол-во продукта (20 нг в мкл и выше), дело уж конечно не в пирофосфатах- откуда бы им взяться, коли буквы не включились в амплификат (его мало)? Скорее всего проблемы с праймерами- посмотрите, нет ли «бомбы» (димер праймеров) внизу, или полимераза дохнет, что вря ли. Если проблема не лечится «в лоб», то просто замешайте исходно большой объем смеси, грубо говоря, накопите продукт экстенсивным путем, и всех делов. Я наверное перегрелся на солнцепёке (отпуск все-таки) — не понимаю в чем проблема плазмида или вставка, одна пара праймеров. По классике в ПЦР сильнее амплифицмруется всегда более короткий фрагмент. Без бутылки не разберешься, дождусь вечера. Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? И на какой стадии (до или после фиксирования в кислоте). Обязательно ли сушить? -Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? Бромий этидием или сибирским зеленым и иже с ними -до или после фиксирования в кислоте. «если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки» Чем тогда думали в Сигма, если сделали столик в камере для фореза из белого пластика, к тому же скользкого в первом случае можно наклеить синей изоленты под место, где карманы)) Но от скольжения избавиться сложно — гель частенько уплывает от любых дуновений во время фореза. хоть гвоздями прибивай Можно ли заменить ТВЕ-буфер на Трис-СІ+EDTA для фореза ДНК, и какой молярности? За Трис.НСI в форезном буфере ставлю кол. Борная кислота испорчена у нас. Похоже, это ко мне . Поставляем наборы готовых гелей для электрофореза ДНК, рассчитанные на использование в ПЦРных лабораториях. В каждый комплект входит пузырёк ТАЭх20 (50 мл) для приготовления литра электрофоретического буферного раствора (EtBr 0,5 мкг/мл). Если нужно, то эти пузырёчки можно продавать и без гелей . Если интересно, то пишите. Ели реклама здесь неуместна, то удалите.
|
 ГОТОВЫЕ_ГЕЛИ_05.pdf