Гематоксилин — эозин
ОКРАСКА ГЕМАТОКСИЛИНОМ — ЭОЗИНОМ
Окраска гематоксилин-эозином — наиболее распространённый метод окрашивания срезов. Этот методпозволяет установить отношения между частями органа, отлично выявляя все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры. Практически во всех случаях независимо от поставленной задачи применяется окраска гематоксилин-эозином. В большинстве случаев для изучения структуры нормального или измененного в результате болезни органа ограничиваются этим методом окраски. В других случаях, когда перед исследователем стоит специальная задача, пользуются особыми методами, окрашивая в то же время параллельно ряд срезов гематоксилин-эозином.
Эта окраска является двойной: гематоксилин — основной краситель — окрашивает ядра клеток, эозин — кислый краситель — красит протоплазму клеток и в меньшей степени — различные неклеточные структуры.
Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева, произрастающего в Америке. Эозин — искусственная краска. Растворы красителей должны быть приготовлены заранее. Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом. Для того чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению, в результате чего он превращается в красящее вещество — гематеин. В соединении с некоторыми солями гематеин дает четкое окрашивание ядер (используют гематоксилин Эрлиха, Майера, железный гематоксилин Гейденгайна).
Эозин — протоплазматический краситель; используется он в виде спиртовых или, гораздо чаще, водных растворов. Для приготовления эозина 0,1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Подготовка срезов к окраске заключается в их кратковременной обработке спиртом. Поскольку при заливке в парафин или целлоидин материал обезвоживается в спиртах, срезы, полученные при этих способах заливки, в особой подготовке для окраски гематоксилин-эозином не нуждаются. Обрабатывать необходимо замороженные срезы. При этом происходит их обезжиривание и другие изменения в структуре, что значительно улучшает окрашивание гематоксилин-эозином. Срезы обрабатывают в 96° спирте не более 3-5 минут. Из спирта срезы переносят обратно в дистиллированную воду. Окраску производят сначала гематоксилином.
Порядок проведения окраски:
| Дистиллированная вода | ополоснуть |
| Раствор гематоксилина | 1-20 мин |
| Солянокислый спирт | дифференцировка |
| Аммиачная вода | срезы синеют (контроль под микроскопом) |
| Проточная вода | 5-10 мин |
| Дистиллированная вода | ополоснуть |
| Раствор эозина | 10с-3 мин |
| Спирт 96%, карбол-ксилол, заключение |
Результат: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые.
Примеры практических микропрепаратов, окрашенных гематоксилином-эозином:
Рис. 1, 2. Болезнь Фара (феррокальциноз). В веществе головного мозга из зоны подкорковых ядер зональное обызвествление (практически без признаков склероза) стенок небольших сосудов (капилляров, мелких артерий и артериол) различной степени выраженности (от пылевидного включения солей кальция в толще стенки до полного замещения сосудистых стенок кальцинатами). Вдоль стенок большинства капилляров густо расположены небольшие округло-овальные кальцинаты по типу псаммом, вокруг отдельных капилляров образованы целые муфты петрификатов.
Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100 и х250.
Рис. 3, 4. Болезнь Фара (феррокальциноз, другое наблюдение). Крупные группы густо расположенных мелких сосудов с наличием циркулярного пылевидного и в виде мелких гранул кальциноза стенок, расположенного между адвентицией сосудов и средней их оболочкой, в толще средней оболочки, полностью замещающего сосудистую стенку. Видны фрагменты сосудистых стенок в косопоперечном, продольном срезе, утолщенные кальцифицированные стенки выглядят как «кусочки вермишели».
Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 5. Очаговый интрамуральный кардиосклероз. Сохранившиеся кардиомиоциты в состоянии выраженной белковой зернистой дистрофии, выраженной гипертрофии.
Рис. 6. Умеренная-выраженная гипертрофия кардиомиоцитов, белковая зернистая их дистрофия. В цитоплазме ряда кардиомиоцитов вокруг ядер расположены мелкие скопления золотисто-жёлтого «пигмента старения» липофусцина. Очаговая круглоклеточная инфильтрация стромы. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 7, 8. Грибковый перикардит (острый гнойно-фибринозный), группа гиалогифомикозов. Очаги выраженной лейкоцитарной инфильтрации с включениями относительно рыхлого фибрина на фоне очагово-диффузных диапедезно-деструктивных кровоизлияний расположены в эпикарде и субэпикардиальной жировой ткани. Здесь же расположены колонии грибковой микрофлоры, относящейся к гиалогифомикозам: хорошо окрашены гематоксилином-эозином, гифы в диаметре около 2-3 мкм, разрастаются пучками от центрального фокуса в виде «кустарника». Некоторые гифы дихотомично делятся. Мицелий септированный.
Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 9, 10. Метастазы плоскоклеточного рака в миокард, субэпикардиальную жировую ткань. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 11. Актиномикоз лёгкого с перифокальной картиной очаговой острой гнойной пневмонии.
Окраска: гематоксилин и эозин.
Рис. 12. Лёгочная миграция личинки аскариды. В просвете альвеолы червеобразная структура розового цвета, свёрнутая в клубок, с признаками её движения (тонкие перифокальные полоски просветления в реактивном гнойном экссудате).
Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 13-15. Грибковая (кандидозная) пневмония. Лёгочная ткань разрушена за счёт выраженного разрастания древовидного мицелия с перифокальной острой гнойно-фибринозной пневмонией. В отдельных полях зрения видны спорангии со спорами.
Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Препараты предоставлены кафедрой судебной медицины Ижевской ГМА, Свердловским ОБСМЭ.
Рис. 16, 17. Грибковая (кандидозная) пневмония. Лёгочная ткань разрушена за счёт выраженного разрастания мицелия с большим количеством спороносцев.
Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100 и х250.
Рис. 18. Криптококкоз лёгкого.
Окраска: гематоксилин и эозин.
Рис. 19. Криптококкоз печени.
Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 20, 21. Печень. Очаговое острое гнойное межуточное воспаление с преобладанием эозинофилов. Очаговое выраженное полнокровие синусоидных капилляров и центральных вен с эритростазами, диапедезными микрогеморрагиями. Гепатоциты в состоянии выраженной белковой зернистой дистрофии, мелко — и крупнокапельной жировой дистрофии. Часть печёночных клеток в состоянии некробиоза-некроза.
Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 22. Выраженная очаговая гидропическая дистрофия гепатоцитов, сочетающаяся с мелко — и крупнокапельной жировой дистрофией печёночных клеток. Окраска: гематоксилин-эозин.
Рис. 23. Гигантоклеточный гепатит. Неравномерное полнокровие синусоидных капилляров. Белковая зернистая дистрофия, признаки неравномерно выраженной их регенерации в виде деления ядер и самих клеток. Диффузно в срезах в большом количестве расположены гигантские многоядерные макрофаги.
Препараты предоставлены кафедрой судебной медицины Ижевской ГМА
Рис. 24, 25. Выраженный очагово-диффузный гемосидероз ткани печени. Большое количество клеток Купфера с цитоплазмой, нагруженной большим количеством буро-коричневого пигмента. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 26-29. Почка с резко выраженной белковой зернистой дистрофией, гидропической (вплоть до баллонной) дистрофией эпителия канальцев, с некробиозом-некрозом отдельных эпителиоцитов и групп клеток различной величины, атрофией ряда канальцев различной степени выраженности. Наличие в просветах части канальцев свежих ярко-красных эритроцитов (гематурия) и выщелоченных эритроцитов, гиалиновых цилиндров, слущенных эпителиоцитов.
Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 30, 31. Выраженный очагово-диффузный гемосидероз селезёнки.
Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 32, 33. Светлоклеточный рак почки.
Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Источник
Замечания по технике окрашивания
библиографическое описание:
Замечания по технике окрашивания — .
код для вставки на форум:
При окраске водными красителями срезы переносят в краситель из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми — из соответствующего раствора спирта. После того как препарат приобретает интенсивную окраску, его промывают в воде или спирте для удаления избытка красителя (дифференцировка), контролируя этот процесс под микроскопом.
Срезы тканей после целлоидиновой и парафиновой заливки, а также полученные на замораживающем микротоме окрашивают в широкогорлых бюксах или на часовых стеклах. Одновременно окрашивают несколько срезов, промывают, дифференцируют и т.д. каждый срез отдельно.
Препараты можно помещать в красящий раствор в специальных контейнерах, предназначенных для одновременного окрашивания большого количества стекол. Если препаратов немного, то рациональнее краситель наносить непосредственно на срез по каплям с помощью пипетки. Остатки красителя можно слить в склянку и использовать повторно. Д. Кисели (1962) предлагал накрывать при этом срезы стеклянным колпаком, а для увлажнения среды оставлять под колпаком смоченную водой вату.
1. ЯДЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЕ
Окрашивание ядер клеток обусловлено двумя механизмами химического взаимодействия: 1) основные красители, например анилиновые, образуют соли в присутствии ДНК и РНК; 2) образуются комплексы с ионами металлов при применении протравы. В практической работе чаще используют протравные красители. К ним относятся гематоксилин, кармин, сафранин, галлоцианин, ализарин. Хорошо окрашивают ядра такие красители, как янус зеленый, основной коричневый, оксазиновые красители (крезиловый фиолетовый, нильский голубой), тионин, азуры, метиленовый синий, основной фуксин, метиловый зеленый и др. Следует упомянуть о хороших результатах окраски ядер соком черники, которая предложена М.Д. Лавдовским еще в 1887 г.
Гематоксилин и способы его приготовления
Гематоксилин имеет растительное происхождение: его получают из эфирного экстракта кампешевого дерева. Гематоксилин хорошо растворяется в спирте и плохо в воде. Красящими свойствами обладает продукт окисления гематоксилина — гематеин, поэтому краситель становится пригодным только после созревания — окисления, на которое требуется от 10 дней до 2—3 нед. Созревание можно ускорить с помощью солей алюминия, хрома, железа и др.
Гематоксилин Эрлиха
1. Гематоксилин кристаллический 2г
2. Спирт 96% 100мл
3. Дистиллированная вода 100 мл
4. Глицерин 100 мл
5. Алюмокалиевые или алюмоаммонийные квасцы 3г
6. Ледяная уксусная кислота 10 мл
Гематоксилин растворяют в спирте, а квасцы — в дистиллированной воде, смешивают оба раствора и затем добавляют остальные компоненты. Раствор периодически перемешивают. Через 10—14 дней он приобретает темно-вишневый цвет, что свидетельствует о готовности красителя. Продолжительность окрашивания гематоксилином Эрлиха 4—6 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной, потом в водопроводной воде, дифференцировка в 1 % солянокислом спирте, восстановление в аммиачной воде и окончательное промывание в дистиллированной воде. Для приготовления солянокислого спирта к 100мл-70% спирта добавляют 1мл концентрированной соляной кислоты. Для приготовления аммиачной воды к 50мл дистиллированной воды добавляют 2 капли крепкого аммиака.
Результат: ядра клеток тёмно-синие(оболочка, хроматин), ядерный матрикс бледно-голубой или прозрачный.
Гематоксилин Делафильда
1. Гематоксилин кристаллический 4гр
2. Спирт 96% 25мл
3. Алюмокалиевые или алюмоаммониевые квасцы 40гр
4. Дистиллированная вода 400мл
Приготовление: спирт+гематоксилин+квасцы=3-4дня на свету, перемешывая,фильтруют+100мл глицерина+100мл метилового спирта=3-4 дня на свету, фильтруют. Перед применением разбавляют в 2 раза дистиллированной водой или 2% раствором алюмокалиевых квасцов.Окрашывание 4-6 минут, промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, восстановление в амиачной воде, промывание в ДВ.В результате хроматин и кариолемма ярко-синие.
Гематоксилин Гарриса
1. Кристалическый гематоксилин 5 гр + спирт 50мл-96%
2. Алюмоамонийные квасцы 100гр+ ДВ 1литр
3. Смешывают + 60мл глицерина + 2,5 оксида ртути. Нагревают до 100С, остужают, фильтруют. Перед использованием до 100мл раствора добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты. Окраска 3-4 минуты, дает чёткие ярко-синие ядра.
Гематоксилин Гарриса в модификации Кисели
1. Кристалическый гематоксилин 1 гр + спирт 10мл-96%
2. Кристалический гематоксилин 20гр + ДВ 200мл
3. Смешивают, доводят до кипения, + 500мг желтого оксида ртути. Остужают, фильтруют, готов к использованию. Окраска 4-6 минут, дает ярко-синие ядра.
Гематоксилин Ганзена
4. Кристалическый гематоксилин 1 гр + спирт 10мл-100%
5. Алюмокалиевые квасцы 20гр+ ДВ 100мл
6. Смешывают + 3мл насыщеного раствора перманганата калия. Нагревают до 100С, остужают, фильтруют. Окраска 3-4 минуты, дает красно-фиолетовые ядра.
Гематоксилин Маллори(водный)
Кристалическый гематоксилин 2,5 гр + алюмоамонийные квасцы 50гр+ ДВ 1литр
Выдержывают 10 суток при 25С, +440мг перманганата калия и 2,5гр тимола, перемешивают,
фильтруют. Синие ядра.
Кислый гемалаун Майера(водный)
1. Кристалический гематоксилин 1 гр
2. Алюмоамонийные квасцы 50гр
4. Йодат натрия 200мг
5. Хлоралгидрат 50гр
6. Лимонная кислота 1 гр
Квасцы растворяют в воде без нагревания, затем добавляют и растворяют гематоксилин, йодат натрия, лимонную кислоту и последним — хлоралгидрат. После растворения всех компонентов краску фильтруют, и она готова к применению.
Продолжительность окрашивания 4—6 мин.
Результат: ядра красно-фиолетовые.
Гематоксилин Кораци (водный)
1. Гематоксилин кристаллический 0,1 г
2. Йодат калия 2—3 кристал
3. Алюмокалиевые квасцы 5 г
4. Дистиллированная вода (теплая) 100 мл
Смесь перемешивают до полного растворения и добавляют 25 мл глицерина. Раствор перед использованием фильтруют. Продолжительность окрашивания 1—2 мин. Результат: ядра ярко-синие.
Железный гематоксилин Гейденгайна
1. Гематоксилин кристаллический 1 г
2. Спирт 96 % 10мл
3. Дистиллированная вода 90 мл
Краситель созревает 4 нед. Добавление 100 мг йодата натрия ускоряет «созревание» — он готов к использованию уже через 1 ч после приготовления. Окрашивание проводят разведенным в 2 раза раствором.
Продолжительность окрашивания 1 —36 ч.
1. Препарат помещают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2—12 ч.
2. Ополаскивают в дистиллированной воде.
3. Окрашивают гематоксилином Гейденгайна 1—36 ч.
4. Промывают в водопроводной воде — 3 смены по 10 мин, затем обезвоживают, просветляют, заключают.
Результат: ядра и цитоплазматические структуры черные и синевато-черные.
Железный гематоксилин Брусси
1. Гематоксилин кристаллический 1 г I
2. Дистиллированная вода при 40 «С 100 мл I
3. Железоаммонийные квасцы 8 г II
4. Дистиллированная вода при 40 «С 100 мл II
Растворы I и II смешивают, фильтруют. Продолжительность окрашивания 30 с—1 мин. Затем промывают в водопроводной воде, обезвоживают, просветляют заключают.
Результат: ядра синевато-черные.
Железный гематоксилин Вейгерта
1. Гематоксилин кристаллический 1 г А
2. Спирт 96 % 100мл А
3. Раствор трихлорида железа гексагидрата 50%-4 мл В
4. Дистиллированная вода 95 мл В
5. Концентрированная соляная кислота 1 мл В
Растворы хранят в отдельных склянках с притертыми пробками. Перед использованием нужное для окрашивания количество краски получают путем смешивания растворов А и Б в пропорции 1:1.
Продолжительность окрашивания 1—2 мин, затем промывают в водопроводной воде.
Результат: ядра черно-синие.
Другие ядерные красители
Кармин
- Кармин 1 г
- Дистиллированная вода 100 мл
- Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют, добавлявляют
- 10 мл 40 % формалина.
Продолжительность окрашивания 30 мин—24 ч. Затем следует промывание в дистиллированной воде, дифференцировать в солянокислом спирте, обезвоживание, просветление и заключение.
Результат: ядра ярко-красные.
Сафранин
Обеспечивает получение хороших результатов после фиксации ткани в тетраоксиде осмия и особенно после применении фиксаторов, содержащих хром.
- Основной раствор:Сафранин-10г + Спирт 96-155мл + Дистилл вода-145мл
- Краситель: -Основной р-р 20мл + Спирт 50%-80мл
Продолжительность окрашивания 24 ч. Затем следуют промывание дистиллированной водой, дифференцировка в солянокислом спирте, дистиллированная вода, обезвоживание, просветление и заключение.
Результат: хроматин ядер и кариолемма ярко-красные.
Галлоцианин
Рекомендуется для окрашивания тканей, залитых в желатин.
- Галлоцианин 100 г
- Хромовые квасцы 5 г
- Дистиллированная вода 100 мл
Сначала растворяют квасцы, затем добавляют Галлоцианин, раствор кипятят при постоянном помешивании, охлаждают, фильтруют. Срок годности красителя 1 мес.
Продолжительность окрашивания 24—48 ч. Затем следуют промывание в 2 сменах дистиллированной воды, обезвоживание, просветление и заключение.
Результат: хроматин и тигроидное вещество синевато-черные.
Сок черники
Свежие чистые ягоды черники разминают в фарфоровой ступке, смешивают с равным объемом 96 % спирта, настаивают 1— 2 сут и фильтруют. Перед окрашиванием часть раствора разводят равным количеством 2 % водного раствора алюмокалиевых квасцов и добавляют 2—3 кристаллика тимола.
Продолжительность окрашивания 5—7 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, промывание в дистиллированной воде, обезвоживание, просветление и заключение.
Результат: ядра темно-фиолетовые.
2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ
Окрашивание цитоплазмы клеток происходит в результате связывания оснований и белков кислотными красителями. В группу диффузных (кислых) красителей входят карбоновые и сульфоновые кислоты, нитро-, азокрасители и др. В гистологической практике постоянно применяют эозины, пикриновую кислоту, оранжевый Г, кислый фуксин, конго красный (конгорот), азокармин, эритрозин. Чаще используют 1 % водные растворы этих красителей, но можно применять и 1 % спиртовой раствор.
Продолжительность окрашивания колеблется от 5 с до 3—5 мин в зависимости от сорта и серии красителя. Если препарат перекрашивается, то излишек краски легко удаляется при ополаскивании в дистиллированной воде и последующем обезвоживании препарата или среза в спиртах.
Смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты (пикрофуксин) готовят из насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1 % водного раствора кислого фуксина (см. главу 22).
3. Методика окраски гематоксилином и эозином
Процедура окрашивания срезов, полученных на замораживающем микротоме, после парафиновой или целлоидиновой заливки различается лишь по техническим приемам, а порядок проведения окраски одинаков.
- Дистиллированная вода ополоснуть
- Раствор гематоксилина 1—20 мин
- Дистиллированная вода ополоснуть
- Солянокислый спирт дифференцировка
- Аммиачная вода срезы синеют (контроль под микроскопом)
- Проточная вода 5—10 мин
- Дистиллированная вода ополоснуть
- Раствор эозина 10 с—3 мин
- Спирт 96 %,
- карбол-ксилол, заключение.
Результат: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые.
похожие статьи
Классификация медико-криминалистических ситуационных экспертиз / Нагорнов М.Н., Леонова Е.Н., Ломакин Ю.В., Светлаков А.В., Емелин В.В., Кочоян А.Л. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №3. — С. 4-8.
Практическое применение источника экспертного света «Светоч-Х» в работе медико-криминалистического отделения / Девятериков А.А., Куличкова Д.В., Шаповалова Е.С. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2019. — №18. — С. 70-73.
Апробация модификации метода цветных отпечатков с использованием тонкого целлофана вместо фотобумаги / Девятериков А.А., Нестеров А.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2017. — №16. — С. 18-24.
Источник