Как приготовить фиксированный препарат бактерий
Для выявления морфологических и структурных особенностей, количественного и видового учета микроорганизмов, проверки чистоты культуры и ряда других целей готовят фиксированные окрашенные препараты, которые могут храниться длительное время.
Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает несколько этапов: приготовление мазка, высушивание, фиксация и окрашивание.
На обезжиренное предметное стекло наносят маленькую каплю стерильной водопроводной воды или стерильного физиологического раствора и бактериологической петлей переносят в нее небольшое количество исследуемого материала. Полученную суспензию равномерно размазывают тонким слоем на площади 1 – 2 см петлей. Мазок должен быть тонким, чтобы клетки в нем располагались в один слой и он высыхал на воздухе тотчас же после приготовления. Мазок следует готовить легкими вращательными движениями, не прилагая усилий, чтобы не нарушить естественного расположения клеток и не повредить их (не оборвать жгутики, не порвать цепочки стрептобацилл, стрептококков и др.).
После высыхания микропрепарата (на воздухе или при легком подогреве) мазок обязательно должен быть подвергнут фиксации.
Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними, обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу, сделать мазок более восприимчивым к окраске (убитые клетки окрашиваются лучше, чем живые). Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом могут произойти грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток (сморщивание и др.).
Для исследования тонкого строения клетки, прибегают к фиксации химическими веществами. В этом случае фиксирующую жидкость либо наливают на мазок, либо препарат на определенное время помещают в сосуд с фиксатором. Чаще всего в качестве жидких фиксаторов используют этиловый спирт (время фиксации 12 – 20 минут), метиловый спирт (время фиксации 3 – 5 минут), смесь Никифорова (смесь 1:1 этилового спирта и эфира, время фиксации 15 – 20 минут). Существуют и другие фиксаторы.
По окончании фиксации препарат отмывают от фиксатора, осторожно обливая его проточной водой.
Источник
Приготовление фиксированных препаратов
Фиксированные (убитые) препараты используют для определения формы, взаимного расположения, особенностей цитологии клеток, для количественного учета микроорганизмов. Фиксированные препараты можно долго хранить, но их нельзя использовать для определения размеров микроорганизмов.
Приготовление фиксированных препаратов включает несколько этапов: приготовление мазка, высушивание, фиксацию, окраску.
1. Приготовление мазка.
На предметное стекло поместить небольшую каплю суспензии микроорганизмов в воде и петлей распределить равномерным тонким слоем на площади 1-2 см 2 . Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал почти сразу после приготовления.
2. Высушивание мазка.
Высушить мазок на воздухе.
3. Фиксация мазка. Цель фиксации — убить микроорганизмы, закрепить их на стекле, сделав клетки более восприимчивыми к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются легче, чем живые.
Самый распространенный способ фиксации — термический. Для этого препарат трижды проводят через верхнюю часть пламени горелки, держа предметное стекло пинцетом мазком вверх. Мазок не следует перегревать, так как это может привести к деформации клеток.
Более щадящей является фиксация различными химическими веществами (95% этанолом, безводным метанолом, парами формалина, 5% фосфорно-молибденовой кислотой, специально разработанными для определенных целей фиксаторами). Химическую фиксацию проводят, наливая на мазок фиксатор и выдерживая его определенное время.
4. Окраска мазка.
Различают простые и дифференциальные способы окраски. При простой окраске прокрашивается вся клетка, дифференциальная окраска позволяет выявить определенные структуры в клетке. Для простого окрашивания используют главным образом основные красители: метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, сафранин.
Фиксированный препарат поместить на стеклянные рейки над ванночкой. На фиксированный мазок нанести несколько капель красителя так, чтобы покрыть всю его поверхность. Краситель выдержать на мазке 3-5 минут, следя за тем, чтобы краситель не подсыхал на мазке. Затем краситель слить в кювету, препарат промыть водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной.
5. Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
6. Микроскопировать. В правильно приготовленном препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.
4 Оформление результатов работы
1. Приготовить препарат исследуемой культуры «раздавленная капля» в воде и в красителе. Рассмотреть с иммерсионной системой, зарисовать.
2. Приготовить препарат исследуемой культуры «висячая капля». Рассмотреть с объективом 40х. Зарисовать.
3. Приготовить два фиксированных препарата, один из которых окрасить метиленовым синим, другой — основным фуксином. Зарисовать микроскопическую картину.
5 Контрольные вопросы
1. Как готовят предметные и покровные стекла к работе?
2. В каких случаях используют прижизненные препараты, а в каких — фиксированные?
3. Почему для окраски препаратов используют чаще всего основные красители?
4. Что такое тинкториальные свойства микроорганизма?
5. Какие методы используют для фиксации мазка на стекле?
6. Почему размеры клеток определяют с помощью прижизненных, а не фиксированных препаратов?
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4.
СТРОЕНИЕ ВЕГЕТАТИВНОГО ТЕЛА ГРИБОВ
Цель работы
Научиться выявлять характерные структуры вегетативного тела грибов.
Приборы и материалы
— жидкость для удаления иммерсионного масла,
— предметные и покровные стёкла,
— микробиологические петли и иглы,
— краситель метиленовый синий,
— чашки Петри со стерильной питательной средой.
Культуры: p.Mucor, p.Aspergillus, p.Penicillium, p.Candida, p. Saccharomyces.
Содержание работы
Вегетативное тело гриба называется таллом (от греч tallos – зелёная ветвь). У представителей царства грибов существуют следующие типы таллома: плазмодий, мицелий, псевдомицелий, одноклеточный (дрожжевидный).
Плазмодий — это амёбоидная масса с большим количеством ядер, не имеющая клеточной стенки. Таллом в виде плазмодия характерен для слизевиков и некоторых низших грибов. Для большинства и низших (Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes) и высших (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes) грибов характерен таллом в виде мицелия (грибницы). Мицелий – сложное переплетение гиф — тонких разветвленных трубочек (рисунок 5). Часто термины таллом и мицелий употребляются как синонимы. Одноклеточный таллом и псевдомицелийхарактерен для дрожжей (рисунок 6). Псевдомицелий морфологически похож на мицелий, но состоит из отдельных, не отделившихся друг от друга клеток (рисунок 6,7).
Типы гиф грибов
Гифа (от греч. hyphe – ткань) — это наиболее характерная морфологическая структура гриба, образующая мицелий. Нитевидной формой гифы всех грибов сходны между собой. Диаметр гиф варьирует у грибов от 2 до 170 мкм. В оболочке гифы заключена цитоплазма, непрерывно образующая новые клетки на конце гифы – апексе (от лат. apex – верхушка, маковка). Это участок длиной около 100 мкм. В нём различают 4 зоны (рисунок 8): максимальной кривизны, максимальной синтетической активности, зону растяжения, зону образования клеточной стенки. Растущие гифы разветвляются в зоне растяжения.
А – мицелий при малом увеличении (в 7 раз); б – мицелий при увеличении в 700 раз
Рисунок 5 – Мицелий грибов
А б
а – одноклеточный таллом; б — псевдомицелий
Рисунок 6 – Одноклеточный таллом и псевдомицелий
Рисунок 7 — Псевдомицелий
α – зона максимальной кривизны; β – зона максимальной синтетической активности; γ – зона растяжения; δ – зона образования регидной клеточной стенки.
Рисунок 8 — Строение апекса гифы (по /9/)
Гифы различаются по внутреннему строению и типу ветвления. По мере роста грибов от главной гифы образуются ответвления – боковые гифы. Типы ветвления гиф представлены на рисунке 9. Наиболее часто гифы грибов ветвятся нерегулярно.
По внутреннему строению гифы различаются наличием и расположением перегородок – септ (рисунок 10). Септы возникают в результате постепенного врастания внутрь гифы цитоплазматической мембраны и внутреннего слоя клеточной стенки. В большинстве случаев септы — это не полностью сросшиеся в центре образования (рисунок 10 Б,В). В их середине имеется пора, через которую происходит миграция цитоплазмы и ядер. Различают простые септы — простой диск с порой в центре, и долипоровые септы — ежегодно утолщающиеся вокруг края поры септы (рисунок 11, Г,Д). У некоторых грибов септы могут быть перфорированы большим количеством микропор. Перед отделением части гифы поры могут замыкаться с образованием перегородки.
Гифы низших грибов классов Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes не содержат регулярно расположенных септ и называются неклеточными, асептированными или ценоцитными (рисунок 10 А). Весь мицелий в этом случае представляет собой единственную многоядерную клетку. При старении, повреждениях в гифах низших грибов могут образовываться одиночные септы и перегородки. У более высоко развитых представителей низших грибов (класс Zygomycetes) есть тенденция к более регулярному септированию гиф.
1 2 3 4 5
1 – нерегулярное; 2 – моноподиальное; 3 – мутовчатое; 4 – дихотомическое;
Рисунок 9 – Типы ветвления гиф грибов
а – несептированные; б,в – септированные
Рисунок 10 – Типы гиф грибов
А,Б,В – простые септы:
А – с порой (1); Б – с порой (1) и тельцем Воронина (2); В – с порой (1), закрытой оптически плотной цитоплазмой (3) и окружённой вакуолями (6);
Г,Д – долипоровые септы: 5 – поровый колпачок; 6 – долипора;
7 – эндоплазматический ретикулум.
Рисунок 11 – Типы септ грибов (по /8/)
Регулярно расположенные по длине гифы септы характерны для высших грибов классов Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes. Такие гифы называются септированными (рисунок 9 б,в).
Типы мицелия
Мицелий, образованный ценоцитными гифами, называется ценоцитным или несептированным. Соответственно, если мицелий образован септированными гифами, то он называется септированным.
Часть мицелия гриба обычно находится над поверхностью субстрата, часть – внутри него. На этом основании различают воздушный и субстратный мицелий. Гифы, образующие субстратный и воздушный мицелий, морфологически различны. Гифы воздушного мицелия более тонкие, ровные, разветвлённые, а субстратные — более толстые, неровные, слабо ветвящиеся, сильно вакуолизированные. Для грибов, паразитирующих на растениях, воздушный мицелий называют экзофитным, субстратный – эндофитным.
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
Источник
2. Приготовление препаратов фиксированных клеток
Фиксированнымисчитают клетки микроорганизмов, в которых прерваны жизненные процессы, но полностью сохранена тонкая структура. Для получения фиксированных препаратов важно правильно подготовить предметные стекла. Они должны быть чистыми и тщательно обезжиренными. Для этого стекла, бывшие в употреблении, выдерживают 1-2 часа в хромовой смеси (в 1 л воды вносят 50 г бихромата калия и 100 г технической серной кислоты), после чего ополаскивают теплой водой и спиртом. Можно также кипятить стекла в течение 15 мин. в растворе соды или мыльной воды. Для проверки чистоты стекла на его поверхность наносят каплю воды. При достаточном обезжиривании капля растекается равномерно и не собирается в выпуклые, медленно высыхающие пузырьки. Берут стекла пинцетом или аккуратно за грани, так как пальцы оставляют на поверхности жирные пятна.
Приготовление фиксированных препаратов ведут в следующей последовательности:
На середину чистого обезжиренного предметного стекла стерильной петлей наносят небольшую каплю воды. В нее вносят исследуемый материал, отобранный по методике, описанной в разделе 1. Полученную суспензию равномерно распределяют по поверхности стекла тонким слоем таким образом, чтобы препарат распределился на площади примерно 2-3 см 2 .
Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе.
Производят фиксацию мазка. Для этого стекло с высохшим мазком проводят 3-4 раза над пламенем горелки той стороной, где мазок отсутствует.
умертвить клетки микроорганизмов и сделать их безопасными (что особенно важно при работе с патогенными микроорганизмами);
зафиксировать (закрепить) мазок на стекле (чтобы они не смывались при окрашивании);
улучшить окрашивание, поскольку мертвые клетки лучше адсорбируют на своей поверхности различные красители.
Приготовление фиксированных препаратов из естественных мест обитания микроорганизмов проводится так же, как и из чистых культур. Помимо термической обработки, применяют также фиксацию химическими веществами: погружают предметное стекло с мазком в мензурку с 96 %-ным этанолом на 15-20 мин, с ацетоном на 5 мин, со смесью 96 % -ного этанола и 40%-ного формалина (соотношение 95:5) на 2 мин. и др.
3.Окраска фиксированных препаратов микроорганизмов простым методом
Фиксированные препараты нельзя рассмотреть под микроскопом, так как они являются бесцветными и пропускают световые лучи. Поэтому их окрашивают, используя простые или сложные методы. При окрашивании фиксированных мазков простыми методами используют один краситель (фуксин, краска Муромцева, генцианвиолет, метиленовая синь и др.). Последовательность окрашивания мазка простыми методами следующая:
На фиксированный препарат наносят несколько капель красителя таким образом, чтобы он покрывал всю поверхность мазка и выдерживают в течение определенного времени. Так, при окраске фуксином на мазок наносят несколько капель красителя и выдерживают его на мазке 2-3 мин.
Краску смывают с мазка слабой струей до бесцветной смывной воды. При этом стекло держат в наклонном положении над лотком.
Мазок подсушивают фильтровальной бумагой, которую осторожно прикладывают к стеклу, и досушивают на воздухе.
На окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом х90 или х100.
Задание 3. Схематически изобразить морфологическую структуру бактериальной клетки:
Задание 4. По памяти зарисовать и подписать основные шаровидные формы бактерий (микрококки, диплококки, тетракокки, сарцины, стрептококки, стафилококки).
Задание 5. По памяти зарисовать и подписать основные палочковидные формы бактерий.
Приложение к лабораторной работе №1
Задание 6. Зарисовать и подписать расположение жгутиков у бактерий (монотрихи, лофотрихи, амфитрихи, перитрихи).
Монотрихи – бактерии с 1 полярно расположенным жгутиком
Лофотрихи – бактерии, на одном конце которых имеется пучок жгутиков
Амфитрихи – бактерии, имеющие пучки жгутиков на обоих полюсах бактериальной клетки
Перитрихи – бактерии, жгутики которых расположены по всей поверхности бактериальной клетки, то есть перитрихеально
Приложение к лабораторной работе №1
Задание 7. Зарисовать и подписать виды расположения спор в теле микроорганизма.
Терминальное расположение спор.
Спора располоагается на полюсе бактерии, и тогда она приобретает форму барабанной палочки.
Центральное расположение спор.
Если споры крупные и располагаются в центре клетки, то палочка может приобретать веретенообразную форму
Субтерминальное расположение спор.
Спора располагается на конце палочки, и тогда она приобретает форму булавы.
Лабораторная работа №3-4
Тема: Морфологические признаки дрожЖей и микроскопических грибов. влияние окружающей среды на микроорганизмы. Стерилизация и дезинфекция.
Цель: Изучить основные признаки дрожжей и микроскопических грибов. Приготовление живых препаратов дрожжей и грибов. Ознакомиться с влиянием окружающей среды на микроорганизмы, изучить методы и способы стерилизации и дезинфекции.
Оборудование, материалы: Микроскоп; термостат; сухожаровый шкаф; препаровальные иглы и бактериологические петли; предметные и покровные стекла; фильтровальная бумага; спиртовка; лоток с рельсами для предметных стекол; разделочные доски, лопатки, обработанные с применением растворов хлорсодержащих препаратов; раствор йодисто-калиевого крахмала; метиленовая синь, пипетки; культуры грибов родов Mucor, Aspergillus, Penicillium, Alternaria; чистая культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Источник