Приготовление фиксированных препаратов
Фиксированные (убитые) препараты используют для определения формы, взаимного расположения, особенностей цитологии клеток, для количественного учета микроорганизмов. Фиксированные препараты можно долго хранить, но их нельзя использовать для определения размеров микроорганизмов.
Приготовление фиксированных препаратов включает несколько этапов: приготовление мазка, высушивание, фиксацию, окраску.
1. Приготовление мазка.
На предметное стекло поместить небольшую каплю суспензии микроорганизмов в воде и петлей распределить равномерным тонким слоем на площади 1-2 см 2 . Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал почти сразу после приготовления.
2. Высушивание мазка.
Высушить мазок на воздухе.
3. Фиксация мазка. Цель фиксации — убить микроорганизмы, закрепить их на стекле, сделав клетки более восприимчивыми к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются легче, чем живые.
Самый распространенный способ фиксации — термический. Для этого препарат трижды проводят через верхнюю часть пламени горелки, держа предметное стекло пинцетом мазком вверх. Мазок не следует перегревать, так как это может привести к деформации клеток.
Более щадящей является фиксация различными химическими веществами (95% этанолом, безводным метанолом, парами формалина, 5% фосфорно-молибденовой кислотой, специально разработанными для определенных целей фиксаторами). Химическую фиксацию проводят, наливая на мазок фиксатор и выдерживая его определенное время.
4. Окраска мазка.
Различают простые и дифференциальные способы окраски. При простой окраске прокрашивается вся клетка, дифференциальная окраска позволяет выявить определенные структуры в клетке. Для простого окрашивания используют главным образом основные красители: метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, сафранин.
Фиксированный препарат поместить на стеклянные рейки над ванночкой. На фиксированный мазок нанести несколько капель красителя так, чтобы покрыть всю его поверхность. Краситель выдержать на мазке 3-5 минут, следя за тем, чтобы краситель не подсыхал на мазке. Затем краситель слить в кювету, препарат промыть водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной.
5. Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
6. Микроскопировать. В правильно приготовленном препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.
4 Оформление результатов работы
1. Приготовить препарат исследуемой культуры «раздавленная капля» в воде и в красителе. Рассмотреть с иммерсионной системой, зарисовать.
2. Приготовить препарат исследуемой культуры «висячая капля». Рассмотреть с объективом 40х. Зарисовать.
3. Приготовить два фиксированных препарата, один из которых окрасить метиленовым синим, другой — основным фуксином. Зарисовать микроскопическую картину.
5 Контрольные вопросы
1. Как готовят предметные и покровные стекла к работе?
2. В каких случаях используют прижизненные препараты, а в каких — фиксированные?
3. Почему для окраски препаратов используют чаще всего основные красители?
4. Что такое тинкториальные свойства микроорганизма?
5. Какие методы используют для фиксации мазка на стекле?
6. Почему размеры клеток определяют с помощью прижизненных, а не фиксированных препаратов?
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4.
СТРОЕНИЕ ВЕГЕТАТИВНОГО ТЕЛА ГРИБОВ
Цель работы
Научиться выявлять характерные структуры вегетативного тела грибов.
Приборы и материалы
— жидкость для удаления иммерсионного масла,
— предметные и покровные стёкла,
— микробиологические петли и иглы,
— краситель метиленовый синий,
— чашки Петри со стерильной питательной средой.
Культуры: p.Mucor, p.Aspergillus, p.Penicillium, p.Candida, p. Saccharomyces.
Содержание работы
Вегетативное тело гриба называется таллом (от греч tallos – зелёная ветвь). У представителей царства грибов существуют следующие типы таллома: плазмодий, мицелий, псевдомицелий, одноклеточный (дрожжевидный).
Плазмодий — это амёбоидная масса с большим количеством ядер, не имеющая клеточной стенки. Таллом в виде плазмодия характерен для слизевиков и некоторых низших грибов. Для большинства и низших (Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes) и высших (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes) грибов характерен таллом в виде мицелия (грибницы). Мицелий – сложное переплетение гиф — тонких разветвленных трубочек (рисунок 5). Часто термины таллом и мицелий употребляются как синонимы. Одноклеточный таллом и псевдомицелийхарактерен для дрожжей (рисунок 6). Псевдомицелий морфологически похож на мицелий, но состоит из отдельных, не отделившихся друг от друга клеток (рисунок 6,7).
Типы гиф грибов
Гифа (от греч. hyphe – ткань) — это наиболее характерная морфологическая структура гриба, образующая мицелий. Нитевидной формой гифы всех грибов сходны между собой. Диаметр гиф варьирует у грибов от 2 до 170 мкм. В оболочке гифы заключена цитоплазма, непрерывно образующая новые клетки на конце гифы – апексе (от лат. apex – верхушка, маковка). Это участок длиной около 100 мкм. В нём различают 4 зоны (рисунок 8): максимальной кривизны, максимальной синтетической активности, зону растяжения, зону образования клеточной стенки. Растущие гифы разветвляются в зоне растяжения.
А – мицелий при малом увеличении (в 7 раз); б – мицелий при увеличении в 700 раз
Рисунок 5 – Мицелий грибов
А б
а – одноклеточный таллом; б — псевдомицелий
Рисунок 6 – Одноклеточный таллом и псевдомицелий
Рисунок 7 — Псевдомицелий
α – зона максимальной кривизны; β – зона максимальной синтетической активности; γ – зона растяжения; δ – зона образования регидной клеточной стенки.
Рисунок 8 — Строение апекса гифы (по /9/)
Гифы различаются по внутреннему строению и типу ветвления. По мере роста грибов от главной гифы образуются ответвления – боковые гифы. Типы ветвления гиф представлены на рисунке 9. Наиболее часто гифы грибов ветвятся нерегулярно.
По внутреннему строению гифы различаются наличием и расположением перегородок – септ (рисунок 10). Септы возникают в результате постепенного врастания внутрь гифы цитоплазматической мембраны и внутреннего слоя клеточной стенки. В большинстве случаев септы — это не полностью сросшиеся в центре образования (рисунок 10 Б,В). В их середине имеется пора, через которую происходит миграция цитоплазмы и ядер. Различают простые септы — простой диск с порой в центре, и долипоровые септы — ежегодно утолщающиеся вокруг края поры септы (рисунок 11, Г,Д). У некоторых грибов септы могут быть перфорированы большим количеством микропор. Перед отделением части гифы поры могут замыкаться с образованием перегородки.
Гифы низших грибов классов Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes не содержат регулярно расположенных септ и называются неклеточными, асептированными или ценоцитными (рисунок 10 А). Весь мицелий в этом случае представляет собой единственную многоядерную клетку. При старении, повреждениях в гифах низших грибов могут образовываться одиночные септы и перегородки. У более высоко развитых представителей низших грибов (класс Zygomycetes) есть тенденция к более регулярному септированию гиф.
1 2 3 4 5
1 – нерегулярное; 2 – моноподиальное; 3 – мутовчатое; 4 – дихотомическое;
Рисунок 9 – Типы ветвления гиф грибов
а – несептированные; б,в – септированные
Рисунок 10 – Типы гиф грибов
А,Б,В – простые септы:
А – с порой (1); Б – с порой (1) и тельцем Воронина (2); В – с порой (1), закрытой оптически плотной цитоплазмой (3) и окружённой вакуолями (6);
Г,Д – долипоровые септы: 5 – поровый колпачок; 6 – долипора;
7 – эндоплазматический ретикулум.
Рисунок 11 – Типы септ грибов (по /8/)
Регулярно расположенные по длине гифы септы характерны для высших грибов классов Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes. Такие гифы называются септированными (рисунок 9 б,в).
Типы мицелия
Мицелий, образованный ценоцитными гифами, называется ценоцитным или несептированным. Соответственно, если мицелий образован септированными гифами, то он называется септированным.
Часть мицелия гриба обычно находится над поверхностью субстрата, часть – внутри него. На этом основании различают воздушный и субстратный мицелий. Гифы, образующие субстратный и воздушный мицелий, морфологически различны. Гифы воздушного мицелия более тонкие, ровные, разветвлённые, а субстратные — более толстые, неровные, слабо ветвящиеся, сильно вакуолизированные. Для грибов, паразитирующих на растениях, воздушный мицелий называют экзофитным, субстратный – эндофитным.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.
Источник
Как приготовить фиксированный препарат микробиология
Для выявления морфологических и структурных особенностей, количественного и видового учета микроорганизмов, проверки чистоты культуры и ряда других целей готовят фиксированные окрашенные препараты, которые могут храниться длительное время.
Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает несколько этапов: приготовление мазка, высушивание, фиксация и окрашивание.
На обезжиренное предметное стекло наносят маленькую каплю стерильной водопроводной воды или стерильного физиологического раствора и бактериологической петлей переносят в нее небольшое количество исследуемого материала. Полученную суспензию равномерно размазывают тонким слоем на площади 1 – 2 см петлей. Мазок должен быть тонким, чтобы клетки в нем располагались в один слой и он высыхал на воздухе тотчас же после приготовления. Мазок следует готовить легкими вращательными движениями, не прилагая усилий, чтобы не нарушить естественного расположения клеток и не повредить их (не оборвать жгутики, не порвать цепочки стрептобацилл, стрептококков и др.).
После высыхания микропрепарата (на воздухе или при легком подогреве) мазок обязательно должен быть подвергнут фиксации.
Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними, обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу, сделать мазок более восприимчивым к окраске (убитые клетки окрашиваются лучше, чем живые). Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом могут произойти грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток (сморщивание и др.).
Для исследования тонкого строения клетки, прибегают к фиксации химическими веществами. В этом случае фиксирующую жидкость либо наливают на мазок, либо препарат на определенное время помещают в сосуд с фиксатором. Чаще всего в качестве жидких фиксаторов используют этиловый спирт (время фиксации 12 – 20 минут), метиловый спирт (время фиксации 3 – 5 минут), смесь Никифорова (смесь 1:1 этилового спирта и эфира, время фиксации 15 – 20 минут). Существуют и другие фиксаторы.
По окончании фиксации препарат отмывают от фиксатора, осторожно обливая его проточной водой.
Источник
1. Приготовление препаратов микроорганизмов
Для просмотра микроорганизмов в оптических микроскопах готовят препараты живых и фиксированных (убитых) клеток.
1.1. Приготовление препаратов живых клеток
Препарат «раздавленная капля» используют для определения формы клеток микроорганизмов, их размеров и взаимного расположения, способа спорообразования, наличия или отсутствия подвижности.
На сухое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды, добавляют к ней небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов или другой исследуемый материал (сенной настой и др.), размешивают, покрывают покровным стеклом. Если исследуют негустые суспензии микробных клеток, то каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля с исследуемым материалом должна быть такой, чтобы после прижимания ее покровным стеклом жидкость не выступала из-под стекла. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой.
Препарат «висячая капля» используют для наблюдения за размножением микроорганизмов, образованием и прорастанием спор, для выявления подвижности и отношения клеток к химическим раздражителям.
Каплю суспензии микроорганизмов петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки (рис. 1.1).
Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что позволяет вести многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят в жидкой питательной среде.
Препарат «отпечаток» используют для изучения естественного расположения клеток в колонии микроорганизмов и чаще всего для исследования формы спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов.
Из агаризованной среды, на которой исследуемые микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и сразу же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом.
Источник