Как приготовить картофельно глюкозный агар

Материалы

HiMedia: инструкция по применению продукции

По всем вопросам обращаться: Почтовый адрес: 123007, Москва, а/я 27.

Офис: 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д. 13 а, кор.3.

Тел/Факс: +7 (495) 940 33 12, 940 33 13, 940 33 14,940 33 96, 940 33 97, 940 33 98.

M096/M096A — Potato Dextrose Agar / Картофельно-глюкозный агар

M403 — Potato Dextrose Broth/ Картофельно-глюкозный бульон

M938 — Potato Dextrose Rose Bengal Agar/ Картофельно-декстрозный агар с бенгальским розовым

Продукция зарегистрирована в Министерстве здравоохранения Российской Федерации (ФСЗ 2009/03706).

Эти среды рекомендуют для выделения и подсчета дрожжевых и плесневых грибов в молочных и других пищевых продуктах. Картофельно-глюкозный агар с бенгальским розовым используют также для стимуляции образования у грибов аскоспор.

Ингредиенты

М096

грамм/литр

М096A

грамм/литр

М403

грамм/литр

М938

грамм/литр

Конечное значение рН (при 25ºС)

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Размешать 39,0 г порошка М096 или М0938 или 41,0 г порошка М096А или 24,0 г порошка М403 в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121ºС) в течение 15 мин. Перед розливом тщательно перемешать. При необходимости получения среды со значением рН 3,5 (специальные работы) ее закисляют добавлением 10%-ной винной кислоты (приблизительно 1 мл кислоты на 100 мл среды). После добавления винной кислоты среду не нагревать!

Принцип и оценка результата:

Эти среды рекомендуются американскими специалистами (1, 2) для выделения и подсчета дрожжевых и плесневых грибов в молочных и других пищевых продуктах (3). Среда М096А рекомендована американской Фармакопеей для определения микробной обсемененности (4),а также используется для стимуляции спорообразования, хранения культур некоторых дерматофитов и дифференциации дерматофитов по пигментообразованию (5).

Картофельный настой и глюкоза обеспечивают обильный рост грибов. При значении рН 5,6, обусловленном присутствием винной кислоты, рост бактерий подавляется. Нагревание среды после ее закисления не рекомендуется, потому что в результате гидролиза агара она теряет желирующие свойства. Бенгальский розовый является красителем, похожим на эозин. Он подавляет распространение некоторых быстро растущих грибов и обладает также антибактериальными свойствами.

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий светло-желтый или розовый (М938) порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному агаровому гелю (М096, М096А и М938).

Цвет и прозрачность готовой среды:

Среды имеет светло-янтарную окраску, прозрачна или слегка опалесцирует, когда в пробирках или чашках Петри формируется гель. В случае среды М938 в чашках Петри формируется розовый прозрачный или слегка опалесцирующий гель.

Кислотность среды:

При 25ºС водные растворы М096 или М938 (3,9% вес/об), а также М096А (4,1% вес/об) имеют рН 5,6 ± 0,2, а раствор М403 (2,4% вес/об) имеет рН 5,1 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 4-5 дней при 22-25ºС.

Штаммы микроорганизмов (АТСС)

Candida albicans (10231)

Saccharomyces cerevisiae (9763)

Рост

Образование аскоспор

Условия и сроки хранения:

Порошок хранить при температуре ниже +25ºС. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить при температуре +2…8ºС.

Источник

ЛАБОРАТОРИЯ МАТОЧНЫХ КУЛЬТУР (ЛМК)

Любая лаборатория по тиражированию мицелия должна опираться на лабораторию маточных культур.

Мы полагаем, что недопустимо совмещать в одних и тех же помещениях тиражирование мицелия и подготовку маточного инокулюма.

В лаборатории маточных культур решаются следующие задачи:

• хранение и поддержание коллекции чистых культур;

• производство инокулюма для его тиражирования;

• контроль стволовых культур по чистоте и морфолого-культуральным параметрам.

как потравить клопов в комнате средство от клопов klopov.net.ua служба по уничтожению насекомых операции ретинированного дистопированного зуба | дистопированный зуб удаление

Выращивание грибов: вешенка, шампиньон, шиитаке

Коллекция чистых культур — это самое важное, чем располагает такая лаборатория. Сохранение стволовых исходных маточных культур — главная задача ЛМК, так как все культуры, хранящиеся в отечественных лабораториях получены путем обмена, покупки или выделения мицелия из плодовых тел. Это значит, что ни одна лаборатория в Украине и России не имеет (на сегодняшний день) истинных маточных культур гибридов. Истинные гибриды получают путем скрещивания двух сортов, либо сорта и дикого штамма. Способ получения сорта является собственностью и «know how» фирмы, и обновить гибрид может только та фирма, которая его получила и имеет исходные родительские формы для его выделения.

Гибриды обычно очень нестойки, поэтому приобретенные гибриды требуют профессионального подхода к их поддержанию и хранению. При квалифицированном хранении и поддержании стволовых маточных культур характерные признаки, обусловленные генетическими особенностями сорта, должны оставаться без изменений.

СРЕДЫ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Основная цель, преследуемая при оптимизации состава сред, используемых для хранения,— максимально замедлить процесс метаболизма, а следовательно, и роста культуры. При этом влажность среды должна быть такова, чтобы в течение года не делать пересевов из-за ее пересыхания.

Чистые культуры хранятся в пробирках на агаризованных питательных средах (рис. 1). Агар-агар — это полисахарид, полученный из определенных сортов морских водорослей. Он не является питательным веществом и служит только для уплотнения среды. В воде агар-агар плавится при температуре 80-100 °С, застывает при 40-45 °С.

Рис. 1. Пробирка с агаризованной питательной средой

Приведем несколько рецептов питательных сред:

• картофельно-глюкозный агар (г/л):

очищенные и измельченные клубни картофеля — 200 г

агар-агар — 15-20 г (или агароид 35-40г)

неохмеленное пивное сусло — 250 мл (0,25 л)

агар-агар — 15-20 г

Пивное сусло можно заменить зерновым отваром.

Для приготовления картофельно-глюкозной среды клубни картофеля отваривают до готовности, отвар фильтруют, объем фильтрата доводят до 1 л. Добавляют глюкозу, агар-агар. Среду нагревают до полного расплавления агар-агара.

Для приготовления сусло-агаровой среды рН сусла должно быть в пределах 4-4,5.

Мицелии вешенки обыкновенной, шампиньона двуспорового хорошо хранятся в среде, где вместо сусла используется зерновой отвар, содержащий все необходимые для роста культуры компоненты.

Приготовленные среды разливают в пробирки (20×200 мм) по 10 мл. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробка должна входить в горлышко пробирки на две трети своей длины, не слишком туго, но и не свободно. При разливе необходимо следить, чтобы среда не смочила края пробирки, иначе к ним могут прилипнуть пробки. В чашки Петри наливают по 15 мл среды, равномерно распределяя ее по дну чашки.

Приготовленные среды готовы для стерилизации. Стерилизуют пробирки со средой при давлении 1,5 атм. в автоклаве в течение 1 часа. После этого пробирки с расплавленной агаровой средой достают из автоклава и укладывают в наклонном положении с таким расчетом, чтобы среда не заходила за 2/3 высоты пробирки, иначе она может смочить пробку, что недопустимо.

Когда среда застынет, пробирки ставят вертикально и дают стечь воде-конденсату (чашки Петри для этого устанавливают вверх дном).

Стерилизованные среды помещают в термостат при 28 °С на несколько дней. Если на поверхности и в толще среды не будет отмечен рост бактерий или колоний плесневых грибов, среды считают стерильными и передают для посева культур.

МЕТОДЫ ХРАНЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Существует два основных метода хранения стволовых маточных культур:

• метод вегетативных пассажей;

• хранение в жидком азоте при температуре -196 °С.

Наиболее приемлемым и доступным для ЛМК является первый способ.

Ниже мы перечислим основные принципы хранения, позволяющие избежать мутаций гибрида при хранении культур:

• оптимизация питательных сред, используемых для хранения;

• использование обедненных питательных сред;

• сокращение частоты пассажей;

• соблюдение условия хранения, максимально замедляющих процессы роста и метаболизма (при температуре +4 . +5 °С);

• использование питательных сред одного состава при каждом очередном пассаже культуры;

Одним из важных параметров хранения является его длительность. Известно, что чем реже пересевается коллекция, тем меньше создается возможностей для мутаций исходной культуры. Для избежания частых пересевов количество единиц каждого хранения одного штамма должно хватать минимум на год.

Хранение чистых культур методом вегетативных пассажей

Для поддержания культур и сохранения коллекции в лаборатории проводят пересев мицелия на свежие питательные среды. Благодаря проведению периодических пересевов культура постоянно находится в работе и проводится контроль ее чистоты.

Пробирку с культурой берут в левую руку на ладонь параллельно расположению пальцев и придерживают большим пальцем так, чтобы скошенная поверхность среды была хорошо видна. В правую руку (как ручку для писания) берут инокуляционную иглу (микологический крючок) и несколько раз проводят ею над пламенем горелки для стерилизации (рис. 2 ,а). Затем мизинцем и безымянным пальцем правой руки вынимают пробку из пробирки и осторожно, по стенке, для охлаждения, вводят крючок. Крючком берут небольшой кусочек мицелия (рис. 2 б). Пробирку с культурой закрывают пробкой.

Берут пробирку со свежей питательной средой. Края пробирки и пробки проводят через пламя горелки(рис. 2, в). На среду переносят кусочек мицелия, закрывают пробкой. На пробирке с посевом обязательно записывают дату инокуляции, номер штамма, количество пересевов.

Рис. 2. Схема пересева мицелия

Пересеянные культуры помещают в термостат при 24-26 °С и оставляют там до полного обрастания культурой субстрата. В течение первых дней желательно вести наблюдение за ростом, так как в это время легче обнаружить загрязнение.

Метод периодических пересевов (метод вегетативных пассажей) является наиболее распространенным методом хранения коллекционных культур. Чем реже происходит пересев коллекции, тем меньше клеточных делений претерпевает культура и тем ближе она по своим свойствам к исходному изоляту. Для того, чтобы избежать частых пересевов, количество единиц хранения должно быть таким, чтобы не пришлось делать дополнительных пассажей в течение срока, на который культура заложена на хранение. Пересевать культуру чаще, чем раз в год, не рекомендуется. Пересеянные культуры можно хранить при комнатной температуре, но оптимальной для хранения культур между пересевами считается температура 4-5 °С.

Хранение чистых культур в жидком азоте при температуре —196 °С

Сведения о хранении культуры в жидком азоте при температуре -196 °С мы приводим из «Справочника миколога-грибника», Киев, «Наукова думка», 1987, с. 420-421.

Перед закладкой на хранение мицелий выдерживают при температуре +5 °С в течение 1-7 суток. Затем в одно- или двухмиллиметровые стеклянные ампулы кладут по 6-8 зерен, обросших мицелием, и добавляют 0,5 мл диметилсульфоксида глицерина — защитной суспензионной среды. Перед замораживанием ампулы с мицелием выдерживают при комнатной температуре в течение одного часа. Замораживание проводят медленно, по технологии, обеспечивающей контроль за процессом охлаждения. Замороженные культуры хранят в рефрижераторе с жидким азотом при темпера-туре-160 . -196 °С. Для восстановления замороженного мицелия ампулы держат на водяной бане при температуре 38 °С, пока не исчезнут последние следы льда. Перед тиражированием данный мицелий необходимо проверить на жизнеспособность и силу роста. Считают, что данный метод позволяет сохранить штаммы длительное время без существенных изменений его генотипа.

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Для пополнения коллекции стволовых маточных культур необходимо уметь выделять чистые культуры. Чистые культуры могут быть выделены из посевного мицелия, из плодовых тел, при проращивании базидиоспор. Мы считаем, что для получения чистых культур гибридных штаммов пригоден только первый способ (выделение из посевного мицелия), так как только этот метод позволяет получить наиболее точную копию штамма.

Получение чистых культур из посевного мицелия

Для получения чистых культур из посевного мицелия берут нераскрытую упаковку коммерческого мицелия, визуально выбирают наилучший участок, протирают оболочку спиртом, делают надрез и переносят несколько зерен в пробирки со скошенной питательной средой. Вся процедура производится в стерильном боксе. Засеянные пробирки инкубируют в термостате при температуре 24-26 °С. Во время инкубации ежедневно проводят микробиологический контроль. Необходимо помнить, что для выделения культуры из коммерческого мицелия нужно пользоваться только продукцией мировых лидеров в производстве мицелия (например, фирмы «Sylvan»). В таком случае вы можете получить культуру гибрида пятого поколения.

Выделение чистых культур из плодовых тел

Если нет возможности выделения чистой культуры из коммерческого мицелия ведущих производителей, то в исключительных случаях можно получить чистую культуру из плодового тела. Выделение чистой мицелярной культуры необходимо проводить из плодовых тел гибридных штаммов. Для этого следует выбрать молодые неповрежденные плодовые тела. Проводить выделение лучше в день сбора.

Плодовое тело кладут на фильтровальную бумагу, разламывают и из середины (в месте перехода ножки в шляпку) стерильным скальпелем отрезают кусочки ткани размером 0,5-1 см, каждый кусочек накалывают стерильной инокуляционной иглой, на несколько секунд опускают в стаканчик с 3-процентным раствором перекиси водорода и осторожно, над пламенем горелки, переносят в пробирки на питательную среду. В каждую пробирку помещают только один кусочек, что важно для предотвращения заражения. Пробирки с инокулюмом помещают в термостат при температуре 24 — 26 °С. Уже через два дня кусочки плодового тела в пробирках опушаются растущим мицелием. В процессе роста проводят микробиологический контроль.

Рис. 3. Схема выделения чистых культур из плодовых тел

Выделение чистых культур из базидиоспор

Посев базидиоспор можно производить непосредственно из плодовых тел методом Фриза. Шляпку гриба прикрепляют с помощью вазелина к внутренней стороне крышки пустой стерильной чашки Петри, агаровую стерильную среду разливают слоем 2-3 см в другие чашки, крышки которых поочередно на 5 минут заменяют крышкой со шляпкой. За это время в чашку успевает попасть от нескольких сотен до нескольких тысяч базидиоспор. Все операции проводят в стерильном боксе или ламинарном шкафу. Чашки Петри ставят в термостат при температуре 24-26 °С. При прорастании базидиоспор постоянно производят микробиологический контроль.

Очистка мицелия от посторонних загрязнителей

Выделенные тем или иным способом культуры могут быть поражены колониями плесневых грибов, дрожжей, бактерий, что обычно легко заметить. Если поражение небольшое, то можно попытаться очистить культуру. При этом выбирают неповрежденные участки мицелия и стерильной инокуляционной петлей переносят на чистую среду с обязательным последующим микроскопическим контролем.

При необходимости можно делать несколько пересевов, чтобы убедиться, что культура действительно чистая. Перед тиражированием такой культуры ее обязательно проверяют.

Источник