Гематология: методы Взятие крови из пальца Исследование морфологии эритроцитов Морфология лейкоцитов Методы исследования фагоцитоза in vitro Окраска по Райту Окраска по Лейшману. Окраска по Май-Грюнвальду Окраска по Нохту Окраска по Романовскому Окраска по Фрейфельд Определения Т- и В-лимфоцитов в периферической крови. Получение лейкоконцентрата Приготовление и фиксация мазков крови Приготовление мазков крови унифицированным методом Ретикулоциты Цитопатология клеток крови. Эритроцитометрия Эритроциты
Фиксатор-краситель эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду
Фиксатор-краситель по Май-Грюнвальду в растворе, далее по тексту — фиксатор-краситель, предназначен для применения в качестве фиксатора и красителя форменных элементов крови.
Фиксатор-краситель представляет собой 0,30% раствор сухого красителя эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду в метаноле.
Подготовка к анализу
Приготовление нейтрализованной воды
Взвесить на аналитических весах с точностью ± 0,01 г 9,50 г натрия фосфорнокислого двузамещенного безводного или 22,70 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного; навеску перенести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл, добавить 900 мл дистиллированной воды, перемешать до растворения, довести до 1000 мл дистиллированной водой и тщательно перемешать (раствор 1).
Взвесить на аналитических весах с точностью ± 0,01 г 9,07 г калия фосфорнокислого однозамещенного; навеску внести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл, добавить 900 мл дистиллированной воды, перемешать до растворения, довести до 1000 мл дистиллированной водой и тщательно перемешать (раствор 2).
Внести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл 63 мл раствора 1 и 37 мл раствора 2, довести до 1000 мл дистиллированной водой и определить рН полученной нейтрализованной воды на рН-метре; рН должен находиться в диапазоне 6,8 — 7,2.
Полученную нейтрализованную воду можно хранить при комнатной температуре (+18 — 25°С).
Приготовление мазков крови
Мазки крови сделать на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного стекла следующим образом.
Взять предметное стекло за длинные края и прикоснуться его поверхностью, отступив на 0,5 — 1 см от узкого края, к капле крови (но не к коже). Предметное стекло следует держать на столе или в левой руке за края. Правой рукой приставить шлифованное стекло узким краем к предметному стеклу с кровью слева от капли под углом 45° и продвинуть его вправо до соприкосновения с каплей крови. Выждать до тех пор, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением провести его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на предметном стекле, не доходя 1 — 1,5 см до его края. Сильно нажимать на стекло нельзя, так как многие клетки крови могут оказаться поврежденными. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается “метелочкой”.
После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска; при медленном высыхании может изменяться морфология клеток. Уложить препараты мазками кверху на стеклянный мостик для окраски.
Непосредственно перед определением приготовить рабочий раствор красителя азур-эозин по Романовскому: смешать раствор красителя с нейтрализованной водой в соотношении 1:10 — 1:20 и профильтровать. Полученный рабочий раствор красителя можно хранить в течение 6 часов.
На нефиксированные мазки крови налить неразбавленный раствор фиксатора-красителя так, чтобы он покрыл весь мазок. Через 3 мин. смыть фиксатор-краситель нейтрализованной водой и далее красить рабочим раствором красителя азур-эозин по Романовскому в течение 15 — 45 мин. По истечении этого времени препараты промыть нейтрализованной водой, высушить на воздухе и микроскопировать.
Непосредственно перед определением разбавить фиксатор-краситель нейтрализованной водой в соотношении 1:2 — 1:5. Полученный разбавленный раствор фиксатора-красителя можно хранить в течение 6 часов.
На нефиксированные мазки крови налить неразбавленный раствор фиксатора-красителя так, чтобы он покрыл весь мазок. Через 3 мин. смыть фиксатор-краситель нейтрализованной водой и далее красить разбавленным раствором фиксатора-красителя в течение 5 — 15 мин. По истечении этого времени препараты промыть нейтрализованной водой, высушить на воздухе и микроскопировать.
Окраска форменных элементов крови должна быть следующей:
ЭРИТРОЦИТЫ — розовые, розовые с серым или бежевым оттенком, бежево-коричневые;
ТРОМБОЦИТЫ— розово-фиолетовые или фиолетовые;
ЯДРА ЛИМФОЦИТОВ, МОНОЦИТОВ И НЕЙТРОФИЛОВ — фиолетовые;
ЦИТОПЛАЗМА ЛИМФОЦИТОВ — голубая, серо-голубая или сине-голубая;
ЦИТОПЛАЗМА МОНОЦИТОВ— серо-голубая;
ЦИТОПЛАЗМА НЕЙТРОФИЛОВ — бледно-розовая или розово-серая;
ЗЕРНИСТОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ — фиолетовая или красно-фиолетовая;
ЗЕРНИСТОСТЬ ЭОЗИНОФИЛОВ — оранжево-красная, розово-красная или розово-фиолетовая;
ЗЕРНИСТОСТЬ БАЗОФИЛОВ — фиолетовая.
1. Вместо фиксатора Май – Грюнвальда можно использовать фиксаторы Лейшмана и Йеннера. Они отличаются только по способу приготовления, а результат окраски тот же самый.
2. Можно сделать рабочий раствор на фосфатном буфере с рН 6.8-7.0. Результаты будут стабильными.
4. Количества растворов азура и эозина в рабочем растворе нуждаются в корректировке, это становится понятным после просмотра первых срезов. Особенно это необходимо при использовании несертифицированных красителей (без C.I. и сертификата BSC).
5. Вместо рабочего раствора азура и эозина можно пользоваться коммерческим раствором краски Романовского. Перед использованием в рутине оттестировать разведение, рН и время окрашивания.
6. При появлении мелких синих хлопьев азура в растворе он не пригоден для окраски. Сделать свежий раствор. Посуда для всех красителей в цитологии должна быть безупречно чистой. После отмывки осадков старых растворов посуда промывается дистиллированной водой и высушивается досуха. В ней не должно быть никаких остатков моющих средств.
7. Однажды приготовленный рабочий раствор годен в течение 1 или 2 рабочих дней независимо от количества партий, которые проходят в течение дня.
8. Дистиллированная вода для промывки должна иметь рН не ниже 6. При хранении дистиллированная вода закисляется. Если есть возможность, для промывки использовать фосфатный буфер с рН 6.8-7.0. Или любой другой буфер с аналогичной рН.
ССЫЛКИ: Ромейс (1953), Лилли (1962).
Источник
2. Рецепты приготовления красок и реактивов для окрашивания бактериальных препаратов
Принцип приготовления насыщенных спиртовых растворов красок
В основе приготовления многих красящих растворов лежит предварительное получение насыщенных спиртовых растворов красок, способ изготовления которых в принципе одинаков для всех красителей.
Порошки красок в определенном для каждого красителя количестве (указанном ниже) высыпают во флаконы, заливают 96 % этиловым спиртом и ставят на 18–24 ч в термостат с 37 °С, периодически взбалтывая.
В течение указанного времени значительная часть краски растворяется, оставляя только на дне флакона небольшой осадок.
Насыщенные растворы красок могут храниться долгое время во флаконах темного стекла со стеклянными притертыми крышками или резиновыми пробками.
Принцип приготовления рабочих спиртоводных растворов красок
Спиртоводные растворы красок готовят из насыщенных спиртовых растворов. Для этого в небольшое количество насыщенного спиртового раствора краски добавляют дистиллированную воду в разных соотношениях (в зависимости от красителя).
Дистиллированная вода 100 мл Перемешать в указанном порядке перечисленные выше ингредиенты. Краска должна быть подвергнута «созреванию», которое протекает в течение нескольких месяцев. Процесс «созревания» может быть ускорен при аэрации раствора. Для этого посуду заполняют краской не более чем наполовину, вместо пробки используют рыхлый ватный тампон. Содержимое флакона должно часто перемешиваться. Во время хранения свойства краски улучшаются. Щелочные растворы метиленового синего устойчивы и могут храниться во флаконе со стеклянной или резиновой пробкой длительное время, не изменяя своих свойств.
Для окраски зерен валютина непосредственно перед окраской смешивают 2 части первого раствора с 1 частью второго раствора.
Метиленовый синий 0,1 г
Этиловый 96 % спирт 5 мл
Ледяная уксусная кислота 5 мл
Дистиллированная вода 100 мл
Хризойдин или везувин 1,0 г
Дистиллированная вода 300 мл
Краску растворяют в кипящей воде и фильтруют через бумагу. Для приготовления рабочего раствора непосредственно перед применением смешать 2 части раствора первой краски и 1 часть раствора второй краски.
Рецепт 11. Водный раствор метиленового синего
Метиленовый синий 1,0 г
Дистиллированная вода 1000 мл
Применяется для ориентировочной окраски препаратов, при окраске по Цилю–Нильсену кислотоустойчивых бактерий, дает отчетливо окрашенные клетки микроорганизмов на нежно-голубом фоне.
Кристаллический фиолетовый всегда может быть заменен генциановым или метиловым фиолетовым, поскольку эти красители относятся к одному классу химических соединений, очень близки по структуре, составу химической формулы и имеют совершенно одинаковый эффект окраски.
Рецепт 13. Спиртоводный раствор кристаллического фиолетового Насыщенный спиртовой раствор кристаллического фиолетового 1 мл Дистиллированная вода 10 мл Раствор нестойкий, готовится на 1–2 дня
Рецепт 14. Карболовый раствор кристаллического фиолетового Пропись 1 Кристаллический фиолетовый 1,0 г Фенол кристаллический 2,0 г Этиловый 96 % спирт 10 мл Дистиллированная вода 100 мл Карболовый раствор кристаллического фиолетового 1 г растирают в фарфоровой ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями приливают спирт. После того как краска хорошо разотрется, приливают при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Краска нестойкая. Пропись 2 Насыщенный спиртовой раствор кристаллического фиолетового 10 мл Фенола 2 % водный раствор 100 мл Полученную смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор краски нестойкий, в прок не готовится.
Рецепт 15. Фуксина насыщенный спиртовой раствор
Основной фуксин 8,0–9,0 г
Спирт 96 % этиловый 100 мл
Рецепт 16. Фуксина спиртоводный раствор
Насыщенный спиртовой раствор фуксина 1 мл
Дистиллированная вода 10 мл
Спиртоводный раствор фуксина нестойкий, поэтому готовят его ex tempore перед окраской препаратов.
Рецепт 17. Фуксин карболовый Циля
Основной фуксин в порошке 1,0 г
Фенол кристаллический 5,0 г
Этиловый 96 % спирт 10 мл
Дистиллированная вода 100 мл
1 г основного кристаллического фуксина растирают в фарфоровой ступке с 5 г кристаллического фенола и несколькими каплями глицерина. Во время растирания фуксина с фенолом небольшими порциями добавляют спирт. После того как краска хорошо разотрется, приливают при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой пробкой.
Насыщенный спиртовой раствор основного фуксина 10 мл
5 % раствор карболовой кислоты 90 мл
Карболовую кислоту вливают в краску! Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют через влажный бумажный фильтр, после чего сливают во флакон темного стекла для хранения.
Рецепт 18. Фуксин Пфейффера Карболовый фуксин Циля 1 мл Дистиллированная вода 9 мл Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. Полученный раствор краски очень нестойкий, поэтому его готовят в небольших количествах только для работы на текущий день.
Красители и реагенты для окраски по Граму в модификации Г.П.Калины Рецепт 19. Бриллиантового зеленого спиртовой раствор Бриллиантовый зеленый 0,05 г Этиловый 96 % спирт 10 мл Краска хранится длительное время во флаконе темного стекла, в темноте, закрытая стеклянной притертой или резиновой пробкой.
Рецепт 20. Основной реактив Калины для окраски нейссерий по Граму 5 % раствор основного фуксина Циля 2 мл 5 % раствор спиртового раствора йода 2 мл 0,5 % спиртовой раствор йодида калия 96 мл 0,5 % раствор йодида калия готовится при подогревании на водяной бане. После полного растворения навески йодида калия в 96 % спирте последний соединяют с растворами фуксина и йода. Полученную смесь хранят во флаконе темного стекла с притертой пробкой в холодильнике.
Приготовление красящих бумажек по Синеву
Для приготовления красящих бумажек пользуются стандартной фильтровальной бумагой, которую предварительно испытывают на пригодность. Для этого отрезают полоску бумаги и погружают в спиртовой раствор красителя, затем высушивают на воздухе. Хорошая бумага окрашивается равномерно, без пятен. Затем от нее отрезают небольшой кусок и кладут на стекло с несколькими каплями воды. Пригодная для окраски бумага сразу пропитывается водой и через несколько секунд «отдает» краситель, вследствие чего вода вокруг становится интенсивно окрашенной в соответствующий цвет. Если этого не происходит, бумага для приготовления красящих бумажек непригодна.
Техника приготовления красящих бумажек. Краситель, предназначенный для пропитывания бумаги, наливают в лоток или глубокую тарелку. Бумагу нарезают в виде полосок шириной 2–2,5 см и длиной 30–50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краситель так, чтобы смачивались обе ее поверхности. Окрашенные полосы вынимают пинцетом, дают красителю стечь и подвешивают на веревке для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре или в термостате при 37–50 °С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2×2 или 2×4,5 см.
Рецепт 26. Прописи растворов красителей для приготовления бумаги
Кристаллический генциановый или метиловый фиолетовый для окраски по Граму
