Как приготовит кровяной агар

Агаровая основа крови, использование и подготовка

кровяной агар это обогащенная твердая среда, дифференциальная, но не селективная. Он используется для восстановления и роста большого разнообразия микроорганизмов из клинических образцов или субкультур..

Классический кровяной агар должен быть включен для посева большинства клинических образцов, полученных в лаборатории; за исключением образцов кала, где это бесполезно, если только они не подготовлены с определенными модификациями.

Эта культуральная среда в основном состоит из обогащенного базового агара и 5% крови. Основа агара может варьироваться в зависимости от потребностей, но в основном будет состоять из пептонов, аминокислот, витаминов, мясного экстракта, хлорида натрия, агара и других..

Что касается крови, обычно требуется контакт с биотерием для получения крови от животных, таких как овцы, кролики или лошади. Однако это не всегда возможно, и иногда используется человеческая кровь.

Среда с кровяным агаром может быть приготовлена ​​в лаборатории или приобретена для компаний, которые ей посвящены. Приготовление этой среды является одним из самых деликатных, любая небрежность при ее приготовлении приведет к загрязнению партии.

Вот почему должны быть приняты все возможные меры предосторожности, и, в конце концов, должен быть проведен контроль качества инкубирования при 37 ° С на 1 чашку на каждые 100 приготовленных.

• 1 фундамент
• 2 использования
  • 2.1 Выбор группы крови
  • 2.2 Выбор типа базового агара
  • 2.3 Использование кровяного агара в соответствии с базовой средой, использованной для его приготовления
• 3 Подготовка
  • 3.1 Взвешивать и растворять
  • 3.2 Стерилизовать
  • 3.3 Агрегация крови
  • 3.4 Разлить в чашки Петри
• 4 Ссылки

фундамент

Уже упоминалось, что кровяной агар обладает характеристикой обогащенной, дифференцированной и неселективной среды. Основание каждого из этих свойств объясняется ниже.

Кровяной агар является обогащенной средой, поскольку он содержит в качестве основной добавки 5-10% крови на основе агара. Оба соединения содержат много питательных веществ, и это свойство позволяет большинству пригодных для культивирования бактерий расти в нем..

Этот рост происходит без ограничений; по этой причине это неселективно. Однако, если в эту среду добавляются соединения, которые предотвращают рост некоторых микроорганизмов и способствуют росту других, он становится селективным. Это тот случай, если определенные типы антибиотиков или противогрибковых добавляются.

Точно так же кровяной агар является дифференциальной средой, поскольку он позволяет различать 3 типа бактерий: бета-гемолитические, альфа-гемолитические и гамма-гемолитические..

Бета-гемолитики — это те, которые обладают способностью лизировать или полностью разрушать эритроциты, образуя прозрачный ореол вокруг колоний, таким образом вызывая β или β гемолиз — гемолиз, а микроорганизмы называются β-гемолитическими..

Примерами ß-гемолитических бактерий являются Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae.

Альфа-гемолитики — это те, которые выполняют частичный гемолиз, где гемоглобин окисляется до метгемоглобина, создавая зеленоватую окраску вокруг колоний. Это явление известно как гемолиз α или α-гемолиз, а бактерии классифицируются как α-гемолитические..

Примером α-гемолитических бактерий являются Streptococcus pneumoniae и стрептококк группы viridans.

Наконец, существуют бактерии, называемые гамма-гемолитическими или негемолитическими. Они растут на агаре, не вызывая изменений на нем, эффект, известный как γ-гемолиз, а микроорганизмы являются γ-гемолитическими..

Пример γ-гемолитических бактерий: некоторые штаммы Streptococcus группы D (Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis).

приложений

Культуральная среда с агаром крови является одной из наиболее часто используемых в лаборатории микробиологии..

Среди микроорганизмов, способных расти на агаризованной среде крови: строгие, факультативные, микроаэрофильные, анаэробные, грамположительные или грамотрицательные аэробные бактерии, быстрорастущие или медленнорастущие бактерии..

Некоторые бактерии, которые требуют или мешают с точки зрения питания, а также грибки и дрожжи, также растут. Аналогично, это полезно для субкультуры или реактивации штаммов, которые очень слабо метаболически.

Однако выбор типа крови и основного агара будет варьироваться в зависимости от вероятного микроорганизма, который подозревается в выздоровлении, и от использования бляшки (культура или антибиограмма)..

Выбор группы крови

Кровь может быть ягнёнком, кроликом, лошадью или человеком.

Наиболее рекомендуемой является кровь ягненка, за некоторыми исключениями. Например, для выделения видов Haemophilus, где рекомендуемой кровью является лошадь или кролик, поскольку в крови ягненка содержатся ферменты, которые ингибируют фактор V.

Наименее рекомендуемым является человек, однако он наиболее часто используется, возможно, потому, что его легче всего получить..

Кровь должна быть дефибринирована, получена без каких-либо добавок и от здоровых животных. Для использования человеческой крови необходимо учитывать несколько факторов:

Если кровь поступает от людей, перенесших бактериальные инфекции, у них будут специфические антитела. В этих условиях рост некоторых бактерий, вероятно, будет подавлен.

Если он получен из банка крови, он содержит цитрат, и возможно, что некоторые бактерии не развиваются в его присутствии. С другой стороны, если кровь поступает от пациентов, принимающих антибиотики, рост чувствительных бактерий может быть замедлен.

И если кровь от диабетика, избыток глюкозы мешает правильному развитию паттернов гемолиза..

Выбор типа базового агара

Базовый агар, используемый для приготовления кровяного агара, может быть очень широким. Среди них: питательный агар, агар для инфузии мозга, соевый агар с триптиказой, агар Müeller Hinton, агар Thayer Martin, агар Columbia, агар Brucella, агар Campylobacter и т. Д..

Использование кровяного агара в соответствии с базовой средой, используемой для его приготовления

Питательный агар

Эта база используется реже всего, потому что на ней будут расти в основном нетребовательные бактерии, такие как кишечные палочки, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp., среди других. Не рекомендуется выделять стрептококк.

Инфузионный агар для сердца (BHI)

Он является одним из наиболее используемых в качестве основы кровяного агара, поскольку в нем содержатся необходимые питательные вещества для роста большинства бактерий, в том числе Streptococcus sp и другие требовательные бактерии. Хотя не следует соблюдать закономерности гемолиза.

Кровь ягненка обычно используется с этой основой.

Также могут быть приготовлены варианты с кровяным агаром, где добавляются другие соединения для выделения определенных микроорганизмов. Например, инфузионный агар мозга с добавлением кроличьей крови, цистина и глюкозы служит для выделения Francisella tularensis.

Принимая во внимание, что с цистином теллурит полезен для выделения Corynebacterium diphteriae. Вы можете использовать кровь человека или ягненка.

В первом случае бета-гемолиз будет выглядеть как узкое гало, а во втором гало будет гораздо шире.

Аналогично, эта основа вместе с бацитрацином, кукурузным крахмалом, лошадиной кровью и другими добавками для обогащения (IsoVitaleX), используется для выделения рода Haemophilus sp из дыхательных проб.

Кроме того, если вы добавляете комбинацию антибиотиков хлорамфеникол — гентамицин или пенициллин — стрептомицин с лошадиной кровью, это идеально подходит для выделения требовательных патогенных грибов, даже с более высоким выходом, чем глюкозный агар Сабура. Это особенно полезно в изоляции Histoplasma capsulatum.

Триптивная соя

Эта база является наиболее рекомендуемой для лучшего наблюдения за характером гемолиза и выполнения диагностических тестов, таких как таксоны оптохина и бацитрацина. Это классический кровяной агар, который обычно используется.

С помощью этой базы вы также можете приготовить специальный кровяной агар для Corynebacterium diphteriae, с теллур цистином и кровь ягненка.

Аналогично, комбинация этого агара с кровью ягненка плюс канамицин-ванкомицин идеальна для роста анаэробов, особенно Bacteroides sp.

Агар Мюллер Хинтон

Эта основа с добавлением крови используется для выполнения антибиограммы требовательных микроорганизмов, таких как Streptococcus sp.

Это также полезно для выделения таких бактерий, как Legionella pneumophila.

Агар Тайер Мартин

Эта среда идеально подходит в качестве основы для кровяного агара, когда подозревается род Neisseria, особенно Neisseria meningitidis, в качестве N. gonorrhoeae не растет на кровяном агаре.

Он также служит для проведения тестов на чувствительность к Neisseria meningitidis.

Агар Колумбия

Эта база отлично подходит для посева образцов желудочной биопсии в поисках Helicobacter pylori.

Среду готовят путем добавления 7% крови ягненка, дефибринированной антибиотиками (ванкомицин, триметоприм, амфотерицин В и цефсулодин), чтобы ограничить рост других типов бактерий, которые могут присутствовать.

Эта же основа с добавлением крови человека или ягненка, налидиксовой кислоты и колистина полезна для выделения Gardnerella vaginalis. Он также идеально подходит для оценки чувствительности к антимикробным препаратам к антибиотикам того же микроорганизма..

Кроме того, он используется для приготовления кровяного агара для выращивания анаэробов, добавления аминогликозидов и ванкомицина.

Эта база позволяет нам правильно наблюдать закономерности гемолиза.

Бруцелла Агар

Эта среда, используемая в качестве основы кровяного агара вместе с добавлением витамина К, идеально подходит для выращивания анаэробных бактерий. В этом случае рекомендуется использовать кровь ягненка.

Кампилобактер агар

Агар Кампилобактер, дополненный 5% овечьей крови и 5 антибиотиками (цефалотин, амфотерицин В, триметоприм, полимиксин В и ванкомицин), является средой, используемой для выделения Campylobacter jejuni в образцах стула.

подготовка

Каждый коммерческий дом несет на обратной стороне упаковки инструкции по приготовлению литра питательной среды. Соответствующие расчеты могут быть сделаны для приготовления желаемого количества, в соответствии с выбранным базовым агаром.

Взвесьте и растворите

Базовый агар поставляется обезвоженным (порошок), поэтому его необходимо растворить в дистиллированной воде, доведенной до pH 7,3.

Количество, указанное выбранным базовым агаром, взвешивают и растворяют в соответствующем количестве воды в фиоле, затем нагревают до умеренного нагрева и перемешивают вращательными движениями до тех пор, пока весь порошок не растворится..

стерилизовать

После растворения стерилизовать в автоклаве при 121 ° С в течение 20 минут..

Агрегат крови

Покидая автоклав, дайте фиоле остыть, пока температура не будет колебаться между 40 и 50 ° C; температура, которую поддерживает человеческая кожа, и в то же время агар еще не затвердел.

Для этого к фиолле прикасаются рукой, и если тепло терпимо, это идеальная температура для добавления соответствующего количества дефибринированной крови (50 мл на литр агара). Аккуратно перемешать до гомогенизации.

Прохождение скопления крови имеет решающее значение, потому что, если это происходит, когда среда очень горячая, красные кровяные клетки будут разрушаться, и среда не будет служить для наблюдения гемолиза..

Если его добавить слишком холодным, образуются комочки, и поверхность среды не будет гладкой, чтобы сделать флейту правильно.

Разлить в чашки Петри

Подавать в стерильных чашках Петри сразу после гомогенизации крови. Приблизительно 20 мл наливают в каждую чашку Петри. Эта процедура выполняется в вытяжном шкафу или рядом с горелкой..

При подаче кровяного агара в чашки Петри на поверхности тарелки не должно оставаться пузырьков воздуха. Если это происходит, пламя горелки Бунзена быстро проходит над пластиной, чтобы устранить их..

Пластинам дают затвердеть и хранят в холодильнике (2-8 ° С) в перевернутом виде до использования. Перед использованием кровяного агара пластины следует закалить (дать им принять комнатную температуру) для посева.

Источник

Основа кровяного агара

Blood Agar Base with low pH
Основа кровяного агара слабокислого M089

Эту среду после добавления крови можно использовать для выделения и культивирования притязательных микроорганизмов, в том числе таких возбудителей инфекций, как стрептококки и нейссерии.

Blood Agar Base (M073)
Рост Streptococcus pyogenes

Состав**:

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 40,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 50°С и асептично внести до 5% стерильную дефибринированную кровь. Тщательно перемешать и разлить среду в чашки Петри.

Принцип и оценка результата:

Эти среды с настоем сердца используют в качестве основы для приготовления кровяного агара. Основа М073 высокопитательна и может использоваться без добавления крови в качестве среды общего назначения. Так, ее применяли для исследования облученных клеток Escherichia coli (1), фагов Clostridium perfringens (2). Ее можно использовать для изучения фосфатазы стафилококков (3), после добавления соли и агара – для оценки микробной контаминации оборудования и свиных туш (4) или определения галотолерантности морских флавобактерий (5). Эту среду применяли для получения антигенов Salmonella typhi (6). Ее можно обогатить внесением крови или сыворотки. После добавления крови она подходит для определения гемолитических реакций, но результат зависит от видовой принадлежности крови. Так, баранья кровь дает наилучшие результаты для тестирования стрептококков группы А (7). При использовании лошадиной крови колонии Haemophilus haemolyticus дают гемолиз, как и колонии Streptococcus pyogenes (8). Norton (9) установил, что слабокислые значения рН (6,8 ± 0,2) помогают различать гемолитические реакции и способствуют росту на данной среде пневмококков и других стрептококков. Низкие значения рН помогают стабилизировать эритроциты, в результате чего формируются четкие зоны гемолиза.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий желтый порошок.

Цвет и прозрачность готовой среды:

Основа среды имеет светло-янтарную окраску, прозрачна или слегка опалесцирует при затвердевании. После добавления крови среда должна иметь вишнево-красный цвет и опалесцирует, если в чашках Петри формируется гель.

Кислотность среды:

При 25°С водный раствор М073 (4,0% вес/об) имеет рН 7,3 ± 0,2; водный раствор М089 (4,0% вес/об) имеет рН 6,8 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 18-48 ч при 35-37°С.

Источник