Как приготовить мазки микроорганизмов

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология

Микроскопия Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (1 мкм = = 10 мм =10 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает в себя обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцентную.
Светлопольная микроскопия. Существуют различные модели учебных и исследовательских световых микроскопов, которые позволяют определить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвижность, степень морфологической гетерогенности, а также характерную для микроорганизмов способность к дифференцирующему окрашиванию. Правила пользования микроскопом. Строгое соблюдение правил пользования микроскопом является непременным условием для каждого работающего с ним.

При работе необходимо соблюдать следующую последовательность:

1. Устанавливают микроскоп в рабочее положение, т.е. так, чтобы колонка была обращена в сторону исследователя, а зеркало — в направлении источника света.
2. Ставят под тубус, пользуясь револьвером, объектив малого увеличения. Как правило, предмет рассматривают вначале при малом увеличении.
3. Проверив, открыта ли диафрагма и поднят ли конденсор, вращают, глядя в окуляр, зеркало и устанавливают его так, чтобы поле зрения оказалось хорошо освещенным.
4. Помещают препарат на предметный столик микроскопа так, чтобы рассматриваемый объект оказался над отверстием столика. Препарат закрепляют с помощью клемм.
5. Находят фокусное расстояние, для чего опускают или поднимают тубус с помощью макрометрического винта. Для окончательной фокусировки пользуются микрометрическим винтом.

При смене объектива, дающего малое увеличение, на объектив большего увеличения требуется соблюдение следующих правил:

1	Прежде чем сменить объектив, рассматриваемый объект (или его участок) ставят в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении. Диаметр линзы уменьшается по мере возрастания степени увеличения, вследствие чего объект, если он лежит не в центре, при смене объектива может оказаться за пределами поля зрения.	Before changing the lens, the object in question (or its section) is placed in the center of the field of view of the microscope at low magnification. The diameter of the lens decreases as the magnification increases, as a result of which the object, if it is not in the center, may be out of sight when the lens is changed.
2	Слегка приподнимают тубус и затем переводят объектив с помо щью револьвера. Это необходимо потому, что объектив большего увели чения всегда бывает длиннее.	Slightly raise the tube and then transfer the lens with a revolver. This is necessary because the lens of higher magnification is always longer.
3	Для того чтобы в поисках фокусного расстояния не раздавить пре парат или, что еще хуже, не повредить линзу объектива, тубус с подведеннымпод него объективом, глядя для контроля сбоку микроскопа, опускают до самой поверхности препарата и затем, смотря в окуляр, очень медленно (чтобы не пропустить появления очертаний предмета) поднимают.	In order not to crush the preparation or, even worse, to damage the objective lens, while searching for the focal length, the tube with the objective underneath it, looking to control the side of the microscope, is lowered to the surface of the preparation and then, looking into the eyepiece, very slowly (so as not to miss the appearance of the outlines of the subject) raise.

Рассматривают препарат в микроскоп левым глазом. Правый глаз при этом должен оставаться открытым. Левую руку держат на микрометрическом винте и слегка вращают его (влево и вправо).

Этим достигается возможность рассмотрения поверхностных и более глубоких участков объекта. Правой (свободной) рукой делают зарисовку того, что видно в поле зрения.

Правила работы с иммерсионным объективом. Сухой окрашенный препарат (приготовление см. ниже) помещают на столик микроскопа и, пользуясь объективом 8х, устанавливают свет.

Затем в центр препарата на мазок наносят каплю иммерсионного масла и заменяют сухую систему иммерсионной. С помощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Эту операцию нужно проводить очень осторожно, следя сбоку за тем, чтобы фронтальная линза не коснулась предметного стекла и не получила повреждения. После погружения объектива в масло осторожно, также пользуясь макровинтом, поднимают тубус и, наблюдая в окуляр, находят плоскость препарата. Точная фокусировка достигается с помощью микрометрического винта. По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же салфеткой, но слегка смоченной ксилолом. Оставлять масло на поверхности линзы ни в коем случае нельзя, так как оно способствует фиксированию пыли и может со временем привести к повреждению оптики микроскопа. Изучение микроорганизмов в световом микроскопе.

Выбор методов микроскопического анализа и способов окраски определяется конкретной целью исследования.

Препараты готовят, как правило, на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,2 — 1,4 мм. Применение более толстых стекол не позволяет получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу. Это достигается протиранием стекол ватой, смоченной эфиром (после этого промывание водой не требуется), или обжиганием поверхности стекол в пламени горелки (жир при этом сгорает).

Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов микроорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15-0,17 мм. Более толстые покровные стекла резко ухудшают качество получаемого изображения. Препараты живых клеток микроорганизмов

1. «Раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей, выращенные в жидкой среде — стерильной пипеткой. В этом случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жид кости необходимо удалить фильтровальной бумагой.

2. «Висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов петлей наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна висеть свободно, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят на жидкой питательной среде. Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

1. Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 — 2 см2 возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал после приготовления.
2. Высушивание мазка. Лучше всего сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает быстро. Если высушивание мазка замедлено, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

3. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, то есть сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обес печить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксатором.

4. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают простые и дифференциальные спо собы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а опре деленных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества. Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой.

Метод окрашивания в модификации

Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Источник

Этапы приготовления мазков-препаратов.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

ПО ОБЩЕЙ МИРОБИОЛОГИИ

С ОСНОВАМИ ОБЩЕЙ И ЧАСТНОЙ ВИРУСОЛОГИИ

САРАНСК

2003

Составители: Л.В. Новикова, И.П. Куторкина, И.С. Романова.

Методические указания к лабораторным занятиям по общей микробиологии с основами общей и частной вирусологии. // Сост.: Л.В.Новикова, И.П.Куторкина, И.С.Романова. – Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2003. – 64 с.

Методические указания написаны в соответствии с программой по микробиологии с вирусологией. Содержат планы занятий, задания для выполнения лабораторной работы, вопросы для самостоятельной подготовки к занятиям, основные методы изучения микроорганизмов и вирусов, дополнительный материал.

Предназначены для студентов III курса дневного отделения биологического факультета специальности «Биоэкология».

Печатается по решению научно-методического совета Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева.

ЗАНЯТИЕ 1

Тема: МИКРОБИОЛОГИЯ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ БИОЭКОЛОГИИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. МОРФОЛОГИЯ МИКРОБОВ.

Цель занятия:ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории, с методами изучения микроорганизмов, освоить технику иммерсионной микроскопии; освоить технику приготовления и простых методов окраски мазков-препаратов.

План занятия.

1. Распространение микробов в окружающей среде. Роль микробов в живой и неживой природе.

2. Микробиологическая лаборатория. Оборудование, правила работы, организация рабочего места.

3. Методы изучения микроорганизмов (микроскопический, бактериологический, экспериментальный, серологический, кожно-аллергический).

4. Микроскопический метод исследования. Виды современных микроскопов. Иммерсионная микроскопия.

5. Тинкториальные свойства бактерий. Этапы приготовления мазков-препаратов. Простые методы окраски.

6. Морфология бактерий. Измерение размеров микробных клеток.

Задания для выполнения лабораторной работы.

1. Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории.

Выполняя микробиологические исследования, необходимо соблюдать следующие правила:

— в лаборатории должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен. В необходимых случаях работающие надевают на лицо маску из марли. Работа с особо опасными микробами регламентируется специальной инструкцией и проводится в режимных лабораториях;

— с инфицированным материалом работают только с помощью инструментов (бактериологические петли, пинцеты, корцанги и др.);

— прикасаться руками к исследуемому материалу запрещается;

— при посеве материала делают надпись на пробирках и чашках Петри и пр.;

— материал высевают в пробирки и чашки Петри вблизи от пламени горелки с обжиганием бактериологической петли и краев пробирки;

— растворы, содержащие патогенные микроорганизмы, забирают пипеткой с помощью резинового баллона;

— в лаборатории запрещается курить и принимать пищу;

— рабочее место должно содержаться в образцовом порядке. Личные вещи следует хранить в специально отведенном месте;

В ходе работы и по ее окончании применяются следующие способы дезинфекции:

— при случайном попадании инфицированного материала на стол, пол и другие поверхности это место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раствором;

— руки обрабатывают дезинфицирующим раствором, а затем моют с мылом;

— помещение дезинфицируют с помощью бактерицидных ламп и путем обработки поверхности лабораторной мебели дезинфицирующим раствором.

2. Ознакомиться с оборудованием микробиологической лаборатории.

Лаборатории снабжены рядом обязательных приборов и аппаратов:

1. Приборы для микроскопии: биологический иммерсионный микроскоп с дополнительными приспособлениями (осветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный конденсор и др.), люминесцентный микроскоп.
2. Термостаты и холодильники.
3. Приборы для приготовления питательных сред, растворов и т.д.: аппарат для получения дистиллированной воды (дистиллятор), технические и аналитические весы, рН-метры, аппаратура для фильтрования, водяные бани, центрифуги.
4. Набор инструментов для манипуляций с микробами: бактериологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.
5. Лабораторная посуда: пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки и др., аппарат для изготовления ватно-марлевых пробок.
6. Аппаратура для стерилизации: автоклавы, сухожаровые шкафы, бактерицидные лампы.

Каждое рабочее место снабжается спиртовкой и сосудом с дезинфицирующим раствором.

3. Приготовить мазок с агаровой культуры стафилококка, окрасить метиленовой синей, изучить под микроскопом.

Этапы приготовления мазков-препаратов.

Приготовление состоит из нескольких последовательных операций: подготовка мазка, высушивание, фиксация и окраска. Исследуемый материал наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Для взятия бактериальной культуры:

— нагревают до покраснения бактериальную петлю в пламени горелки;

— берут пробирку с исследуемой культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцами правой руки к ладони;

— обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут исследуемый материал;

— вынимают петлю, обжигают край пробирки и закрывают пробкой.

— взятый материал осторожно распределяют по предметному стеклу тонким слоем, после чего бактериальную петлю стерилизуют в пламени спиртовки;

— если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора

— мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем горелки. Нельзя допускать закипания материала, т.к. при этом может нарушиться структура микроорганизмов.

— фиксация препарата: высушенные мазки подвергают термической (предметное стекло (мазком вверх) проводят несколько раз через пламя горелки) или химической (фиксирующие растворы: формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнау, ацетон, пары осмиевой кислоты) обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла.

Источник