Как приготовить мазок по граму

Окрашивание бактерий по Граму

Окрашивание бактерий по Граму – метод окраски, позволяющий разделить данную группу прокариотичеких микроорганизмов на грамотрицательные бактерии и грамположительные бактерии [2] .

Окрашивание в фиолетовый цвет
грамположительной бактерии Bacillus thuringiensis

Грамотрицательные и грамположительные бактерии отличаются строением клеточной стенки. Метод окрашивания бактерий по Граму был предложен в 1884 году датским ученым Х. Грамом [2] . К грамотрицательным бактериям, в частности, относятся кишечные палочки, сальмонеллы, бруцеллы, возбудители дизентерии, холеры, уксуснокислые бактерии, семейство Псевдомонадовые (Pseudomonadaceae).

Основы и сущность метода

Метод окрашивания бактерий по Граму основан на различной способности микроорганизмов удерживать в клетке красители трифенилметанового ряда – кристаллический фиолетовый или генциановый фиолетовый. Сущность метода основана на различии в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий [2] [1] .

Как уже было указано, все бактерии по этому признаку делят на две группы:

• грамположительные – красящиеся по Граму;
• грамотрицательные – не красящиеся по Граму [1] .

Техника окрашивания бактерий по Граму

Методика поверки бактерий на окрашивание по Граму включает следующие операции:

1. На обезжиренное предметное стекло наносят в трех местах три капли воды и готовят три тонких мазка различных видовбактерий. При этом по краям располагают контрольные мазки с заведомо известным отношением к окраске по Граму. В центре – мазок исследуемой культуры [1] .
2. Мазки высушивают и фиксируют в пламени спиртовки [1] .
3. Мазки окрашивают в течение одной минуты генцианвиолентом. Для этого на предметное стекло кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной красителем, и смачивают ее водой [1] .
4. Бумажку с красителем удаляют, на препарат наносят раствор Люголя (водой промывать не надо) и выдерживают 60 секунд, до полного почернения мазка [1] .
5. Не промывая водой, препарат обрабатывают 96% спиртом в течение 15–20 с. При этом предметное стекло покачивают. Важно четко соблюдать указанное время обесцвечивания, поскольку при увеличении его продолжительности наблюдается обесцвечивание и грамположительных бактерий[1] .
6. Препарат промывают водой и накладывают на его поверхность полоску фильтровальной бумаги, пропитанной фуксином Пфейфера, смачивают ее водой и окрашивают в течение 60 секунд [1] .
7. Фильтровальную бумагу с красителем удаляют, препарат промывают водой и осушают чистой фильтровальной бумагой [1] .
8. На препарат наносят кедровое масло и рассматривают с иммерсионным объективом [1] .

После такой обработки грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый или синий цвет, а грамотрицательные – в красный [3] [1] .

Источник

Микроскопия влажного мазка влагалищного отделяемого – простой и информативный метод диагностики генитальных инфекций
(старый метод новые подходы).

С момента изобретения микроскопа исследование вагинальной флоры было основным методом диагностики патологии. Внедрение новых технологий в последние годы расширило возможности диагностики инфекций влагалища, но не отменило простой микроскопический метод.

Микроскопическое исследование вагинального отделяемого является наиболее доступным и информативным методом диагностики.

Прямая микроскопия вагинального отделяемого дает возможность сразу после забора увидеть клетки эпителия и микроорганизмы генитального тракта, являясь частью клинического обследования пациенток. Такая микроскопия широко проводится в Европейских странах, метод описан во всех последних иностранных и отечественных руководствах для врачей акушеров-гинекологов.

Можно использовать физраствор, но лучше 0,5% водный раствор метиленового синего (именно этот процент дает лучшую видимость эпителиальных клеток и микробной флоры). Предметные стекла должны быть достаточно тонкими (стандартными), сухими, чистыми, оптимально применять новое стекло для каждой новой пациентки. Для проведения прямой микроскопии нужен только микроскоп с одним или двумя окулярами, обычный или цифровой, все зависит от возможностей врача и учреждения.

Цифровая фотография проникает во все сферы деятельности, в том числе в медицину и лабораторную диагностику. Современные компактные цифровые микроскопы, подключаются к персональному компьютеру или к ноутбуку через USB-разъем. Таким образом, можно использовать экран своего монитора в качестве окуляра, что позволяет увеличить переданное на экран изображение. Передаваемое на экран изображение будет четким, ясным и цветокорректным, что позволит увидеть намного больше, чем в стандартный окуляр микроскопа. Микроскоп может использоваться как цифровой также благодаря тринокулярной насадке. Цифровая фотография позволяет отобразить письменное подтверждение проведенного исследования и внести его в медицинскую документацию, поскольку в медицине важно иметь документальные доказательства тех или иных изменений в состоянии пациента. Цифровая микроскопия нативных (влажных) мазков
— дает возможность просматривать динамику изменений микрофлоры урогенитального тракта,
— обеспечивает возможность консультирования по фото и дистанционно;
— вовлекает пациентку в свое обследование и лечение за счет возможности просмотра на компьютере полученной микроскопии.

Источник

Приготовление мазков и их фиксация

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов:

1) приготовление мазков;

2) высушивание мазка;

3) фиксация мазка;

Для приготовления препарата, на обезжиренное предметное стекло, наносят каплю воды или физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют тонким равномерным слоем по стеклу на площади приблизительно 1 см 2 . Если исследуемый материал находится в жидкой среде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем спиртовки, не давая капле закипать.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3-4 раза через пламя спиртовки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляются к поверхности стекла и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур.

При фиксации с помощью химических веществ используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон. Один из распространенных приемов фиксации — обработка препарата метиловым или этиловым спиртом, или смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира). При этом препарат погружают на 5-20 мин. в фиксирующую жидкость.

Методы окраски мазков и красители, используемые в микробиологии.

Существуют простые и сложные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один из красителей, например, фуксин водный (1-2 мин.), метиленовый синий (3-5 мин.). При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. После истечения времени окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют излишки воды, высушивают на воздухе и микроскопируют.

При сложной окраске последовательно наносятся на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Таковы методы окраски по Грамму, по Цилю-Нильсену, окраска спор по методу Ожешки.

Красители, у которых при диссоциации выделяются водородные ионы, придающие красителю кислый характер, называются кислыми. Они окрашивают (в виде аниона) вещества основной природы. Красители, у которых при диссоциации выделяются гидроксильные ионы, — основными.

В микробиологической практике кислые и основные красители используются в виде солей, так как они способны вступать в реакцию с кислотами и основаниями. Основные красители чаще применяются в виде солей соляной, реже уксусной и серной кислот; кислые красители – в виде натриевых или калийных солей.

Источник