Как приготовить рабочий раствор резазурина

Редуктазная проба с резазурином

Лабораторная работа

Микробиологическое исследование молока – проба на редуктазу. Определение антибиотиков в молоке

Цель работы: Ознакомиться с методиками определения свежести молока пробой на редуктазу с метиленовым голубым и с резазурином, и антибиотиков в молоке. Приобретение навыков микробиологического исследования молока.

Задание

1. Определить свежесть молока пробой на редуктазу с метиленовым голубым и с резазурином.

2. Определить антибиотики в молоке.

Оборудование и реактивы:

Проба молока (свежее и пастеризованное), пробирки с пробкой, раствор резазурина, раствор метиленового синего, водяная баня или термостат, термофильный стрептококк.

Методические указания

Молоко, представляющее собой один из наиболее полноценных продук­тов питания, в то же время является хорошей питательной средой для развития и размножения микроорганизмов. Основными источниками попадания микро­бов в молоко являются вымя и кожный покров животного, руки доильщика, по­суда, воздух и др.

В процессе хранения молока микроорганизмы изменяют его свойства. Для более длительного сохранения первоначальных свойств молока необходи­мо снижать до минимума возможности попадания в него микроорганизмов в процессе хранения и транспортирования.

При исследовании необходимо обращать внимание на количественный состав микрофлоры молока. Это дает возможность правильно вести борьбу с возбудителями порчи молока.

В молоко при нарушении санитарных требований могут попасть бактерии
кишечной группы, маслянокислые, гнилостные (аэробы, анаэробы), дрожжи и
плесневые грибы, которые вызывают различные пороки молока и молочных
продуктов.

Бактерии, попадающие в молоко, в результате жизнедеятельности выделяют ферменты, в частности редуктазу. В только что выдоенном молоке редуктаза отсутствует. Поэтому об общей бактериальной обсемененности молока можно судить по наличию данного фермента.

При нарушении санитарно-гигиенических правил получения и хранения молока количество бактерий в нем возрастает, а следовательно, увеличивается и количество фермента. Редуктаза способна обесцвечивать добавленные к молоку слабые органические красители – раствор метиленовый голубой (метиленовая синь) или резазурин. Обесцвечивание окраски происходит тем быстрее, чем больше в молоке редуктазы, а значит и бактерий. Поэтому по редуктазной пробе судят о санитарных условиях получения молока и о его свежести.

Отбор проб молока

Для бактериологического исследования молоко отбирают в стерильную колбу после тщательного перемешивания в количестве 50 мл. Измеряют темпе­ратуру продукта и охлаждают до 6 °С. Микробиологическое исследование проводят тот час же или не позднее 4 часов с момента отбора проб.

Проба на редуктазу

Для определения бактериальной чистоты и свежести молока проводят пробу на редуктазу, основанную на способности бактерий выделять редуктазу, восстанавливающую краски (метиленовый синий, резазурин). Обесцвечивание метиленового синего и резазурина наступает тем быстрее, чем больше микро­бов в молоке. По скорости обесцвечивания краски молоко разделяют на 4 клас­са (таблица 1).

Показатель	Класс
Время восстановления	более 5,5 ч	5,5-2 ч	2 ч 20 мин	менее 20 мин
Качество молока	хорошее	среднего качества	плохое	очень плохое
Количество микроорганизмов в 1 мл молока	менее 500 тыс.	от 500 тыс. до 4 млн.	от 4 млн. до 20 млн.	более 20 млн.

Постановка пробы

В пробирки наливают 20 мл молока и 1 мл раствора метиленового синего или 10 мл молока и 0,5 мл раствора метиленового синего. После тщательного смешивания пробирки помещают в водяную баню или термостат при температуре 38-40 °С. Такую температуру поддерживают в течение всего опыта до полного обесцвечивания молока. Первые 20 мин наблюдения ведут непрерывно, в дальнейшем просмотр пробирок производят периодически через каждые 15-30 мин.

Обесцвечивание молока может произойти и через 2 часа, и через 5,5 часов после начала анализа. Окончанием опыта считать момент обесцвечивания окраски молока. В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко относят к одному из классов.

Приготовление раствора метиленового синего

5 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего прибавляют к 195 мл дистиллированной воды. Смесь хорошо перемешивают. Срок хранения полученного раствора не более 7 суток.

Метод широко используется ввиду простого выполнения и быстрого по­
лучения результатов.

Редуктазная проба с резазурином

В стерильные пробирки вносят по 1 мл рабочего раствора резазурина и по
10 мл исследуемого молока, закрывают корковыми пробками, смешивают путем
трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в водяную баню
с температурой воды 38°С и защищают от действия прямых солнечных лучей.
Время погружения пробирок в водяную баню считают началом анализа. Показания снимают через 20 минут и через 1 час, не встряхивая и не переворачивая пробирки. Через 20 минут пробирки с обесцвеченным молоком удаляют из во­дяной бани. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхива­нии не учитывается. Оставшиеся пробирки однократно переворачивают и ос­тавляют в бане до конца анализа. В зависимости от времени обесцвечивания и изменения окраски молоко относят к одному из четырех классов:

Источник

3.16. Методы микробиологического анализа

Объединенную пробу объемом 500 см 3 составляют из точечных проб, отобранных из каждой фляги или цистерны после органолептической оценки молока и рассортировки его по кислотности предельным ме­тодом по ГОСТ 3624. Для проведения редуктазной пробы и пробы на наличие ингибирующих веществ из объединенной пробы молока вы­деляют пробу объемом 50–60 см 3 .

Пробу, отправляемую в лабораторию вне данного предприятия, пломбируют или опечатывают и снабжают этикеткой, на которой ука­зывают.

• номер пробы;
• наименование предприятия-поставщика;
• наименование и сорт продукта (молока);
• дату и час отбора проб;
• должность и подпись лица, отобравшего пробу;
• объем необходимых анализов.

Пробы должны храниться и транспортироваться до начала иссле­дований в условиях, обеспечивающих температуру продуктов не выше 6 °С, не допуская подмораживания.

Аппаратура, материалы и реактивы:

• весы лабораторные 2-го класса точности, поверочная цена деле­ния не более 0,001 г для взвешивания реактивов, по ГОСТ 24104;
• весы лабораторные 4-го класса точности, поверочная цена деле­ния не более 0,05 г для приготовления навесок исследуемых об­разцов, по ГОСТ 24104;
• термометры стеклянные жидкостные (не ртутные), диапазон из­мерения 0–100 °С, цена деления шкалы 1 °С, по ГОСТ 28498;
• термостат, позволяющий поддерживать температуру 15–55 °С с отклонением от заданной температуры ± 1 °С;
• стерилизатор паровой медицинский по ГОСТ 19569 или автоклав горизонтальный;
• шкаф сушильный, позволяющий поддерживать температуру (160 ±5) °С;
• анализатор потенциометрический для контроля рН, диапазон измерения рН 3–8, погрешность измерения рН ± 0,05, по ГОСТ 19881;
• редуктазник, позволяющий поддерживать температуру 25–55 °С;
• баня водяная;
• пробор для счета колоний бактерий;
• микроскоп световой биологический по нормативному документу или других аналогичных марок;
• плитка электрическая по ГОСТ 14919;
• спиртовка по ГОСТ 23932;
• петля бактериологическая;
• лупа складная карманная по ГОСТ 25706;
• пробки резиновые конусные по нормативному документу;
• бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;
• пергамент по ГОСТ 1341;
• вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556;
• кастрюли разные по ГОСТ 17151;
• пробойник;
• чашки Петри по ГОСТ 25336;
• стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284;
• бюретки исполнения 1, 2, 3-го класса точности, вместимостью 5, 10, 50 см 3 , цена деления 0,1 см 3 ;
• пипетки исполнения 1, 4, 5, 6, 7 1 и 2-го классов точности, вме­стимостью 1, 2, 5 и 10 см 3 ;
• стаканчики для взвешивания (бюксы) типов СВ и СН по ГОСТ 25336;
• колбы исполнения 2, вместимостью 50, 100, 200, 500, 1000 см 3 2-го класса точности по ГОСТ 1770;
• цилиндры исполнения 1 и 2, вместимостью 50, 100 см 3 по ГОСТ 1770;
• поплавки стеклянные;
• пробирки типов П1, П2, диаметром 16 мм, высотой 150 мм и диа­метром 21 мм, высотой 200 мм по ГОСТ 25336;
• ступки лабораторные фарфоровые по ГОСТ 9147;
• ланцет;
• натрий лимоннокислый 5,5-водный по ГОСТ 22280;
• натрий хлористый по ГОСТ 4233;
• натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
• калия гидроокись по ГОСТ 24363, раствор с массовой концентра­цией 10 г/дм 3 ;
• натрий двууглекислый по ГОСТ 2156, раствор с массовой кон­центрацией 100 г/дм 3 ;
• спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 (на территории РФ действует ГОСТ Р 51652) и спирт этиловый ректификован­ный технический по ГОСТ 18300, 96%-ный раствор;
• масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
• калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198;
• кислота соляная по ГОСТ 3118;
• магний сернокислый по ГОСТ 4523;
• кристаллический фиолетовый по нормативному документу, рас­твор с массовой концентрацией 10 г/дм 3 ;
• метиленовый голубой, индикатор по нормативному документу или аналогичный производства Индии;
• резазурино-натриевая соль по нормативному документу или резазурин в таблетках;
• вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
• вода питьевая по ГОСТ 2874 (на территории РФ действует ГОСТ Р 512321);
• агар микробиологический по ГОСТ 17206;
• пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805;
• желчь бычья и других сельскохозяйственных животных (нативная) по нормативному документу;
• среда сухая Кесслер по нормативному документу;
• среда агаровая модифицированная для определения общего ко­личества бактерий в молоке и молочных продуктах по норматив­ному документу;
• лактоза по нормативному документу;
• порошок сычужный по нормативному документу;
• бумажки индикаторные по нормативному документу или зару­бежного производства;
• индикатор универсальный.

Подготовка к анализу. Подготовка посуды и материалов. Всю новую посуду, предназначенную для бактериологических работ, кипятят в под­кисленной воде (раствор соляной кислоты с объемной долей 1–2 %) в течение 15 мин и затем ополаскивают дистиллированной водой.

Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при (160 ± 5) °С в течение 2 ч или в автоклаве при (121 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин с последующим подсушиванием.

Чашки Петри, пипетки стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вклады­вают кусочек ваты. Резиновые пробки стерилизуют в автоклаве, завер­нутыми в бумагу. При отсутствии аппаратуры для стерилизации (для определения редуктазы, бродильной и сычужно-бродильной проб) посуду, пипетки и пробы непосредственно перед испытанием кипя­тят в дистиллированной воде или конденсате не менее 30 мин. Сте­рильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

Приготовление питательных сред и реактивов. Приготовление рас­твора хлористого натрия. Состав: хлористый натрий – 8,5 г; питьевая вода – 1000 см 3 .

В 1000 см 3 питьевой воды растворяют 8,5 г хлористого натрия, раз­ливают раствор в чистые пробирки диаметром 21 мм по 10 см 3 , а в кол­бы – по 93 см 3 и стерилизуют при (121 ± 2) °С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации в пробирках должно остаться 9 см 3 раствора хло­ристого натрия, а в колбах – 90 см 3 (количество, которое необходимо для приготовления разведений из посевного материала).

Приготовление среды Кесслер (модифицированной). Состав: пептон – 10 г; стерильная желчь – 50 см 3 ; лактоза – 2,5 г; раствор кристалличе­ского фиолетового с массовой концентрацией 10 г/дм 3 – 2 см 3 ; дис­тиллированная вода – до 1000 см 3 .

16 г сухой среды Кесслер помещают в колбу и доливают питьевой водой до 1000 см 3 . Смесь размешивают и кипятят при помешивании (25 ± 5) мин. Объем доводят питьевой водой до 1000 см 3 и фильтруют через вату. Разливают в пробирки с поплавками по 5 см 3 или колбочки с поплавками по 40–50 см 3 и стерилизуют при (121 ± 2) °С в течение (10 ± 1) мин.

Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Допускается приготовление среды Кесслер из отдельных ингреди­ентов.

Для этого к 1000 см 3 питьевой воды прибавляют 10 г пептона и 50 см 3 стерильной желчи (желчь бычья или других сельскохозяйственных жи­вотных), кипятят смесь при помешивании (25 ± 5) мин и фильтруют ее через вату. В полученном фильтрате растворяют 2,5 г лактозы и дово­дят объем питьевой водой до 1000 см 3 , устанавливают реакцию среды (рН 7,4–7,6), после чего добавляют 2 см 3 раствора кристаллического фиолетового с массовой концентрацией 10 г/дм 3 , разливают в пробир­ки с поплавками по 5 см 3 или колбочки с поплавками по 40–50 см 3 и стерилизуют при (121 ± 2) °С в течение (10 ± 1) мин. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Приготовление спиртового раствора метиленового голубого для окра­ски препаратов. 10 г метиленового голубого смешивают со 100 см 3 96%-ного раствора этилового спирта. Раствор ставят в термостат при температуре (37 ± 1) °С на 24 ч, а затем фильтруют в термостате при той же температуре.

Срок хранения раствора метиленового голубого в термостате при температуре (37 ± 1) °С не более 3 мес.

Приготовление краски для препаратов. К 30 см 3 спиртового раство­ра метиленового голубого прибавляют 100 см 3 дистиллированной воды и 1 см 3 раствора гидроокиси калия с массовой концентрацией 10 г/дм 3 .

Для проведения редуктазной пробы с метиленовым голубым гото­вят водный раствор с массовой концентрацией метиленового голубого 0,005 г/см 3 . Для этого 0,5 г метиленового голубого переносят в мер­ную колбу вместимостью 100 см 3 и доводят до метки прокипяченной и охлажденной до (25 ± 2) °С дистиллированной водой. Смесь тщатель­но перемешивают до полного растворения. Срок хранения приготов­ленного раствора не более 12 мес. в банках, защищенных от света.

Для приготовления раствора метиленового голубого с массовой концентрацией метиленового голубого 0,00015 г/см 3 берут 6 см 3 рас­твора с массовой концентрацией 0,005 г/см 3 и смешивают со 194 см 3 дистиллированной воды. Срок хранения приготовленного раствора не более 30 сут в холодильнике.

Приготовление раствора резазурина. Основной раствор резазурина-натриевой соли для редуктазной пробы готовят следующим образом: 100 мг резазурина-натриевой соли переносят в мерную колбу вмести­мостью 200 см 3 и доводят до метки прокипяченной и охлажденной до (25 ± 2) °С дистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения основного раствора резазурин-натриевой соли не более 30 сут при температуре 8–10 °С.

Рабочий раствор резазурин-натриевой соли готовят разбавлени­ем основного раствора прокипяченной и охлажденной до (25 ± 2) ° С дистиллированной водой в соотношении 1 : 2,5 (например, к 10 см 3 основного раствора прибавляют 25 см 3 воды). Массовая доля резазу­рина в рабочем растворе 0,014%.

При использовании резазурина в таблетках для приготовления рабо­чего раствора 1 таблетку растворяют в 50 см 3 прокипяченной и охлаж­денной до (25 ± 2) °С дистиллированной воды. Массовая доля резазу­рина в этом растворе 0,01 %.

Срок хранения рабочего раствора резазурина не более 3 сут при тем­пературе 0–5 °С.

Основной и рабочий раствор хранят в банках, защищенных от света.

Источник