Как приготовить раствор фуксина для окраски

Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия. Мазки окрашивают в течение 3 — 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 % растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Препараты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся недолго.

Результат: бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.

Окраска основным фуксином по Пфейферу

Вместо метиленового синего можно воспользоваться карбол-фуксином либо как таковым, либо в разведенном виде (1:10). Окрашивание длится от 15—30 секунд до 2—3 минут, в зависимости от степени разведения перекрашивания допускают дифференцировку 70° спиртом (10—20—30 секунд).

Окраска основным фуксином по Пфейферу. 1 г основного фуксина растворяют в 10—15 мл этилового спирта и смешивают со 100 мл 5 % раствора фенола. Затем 3 капли полученного раствора добавляют к 10 мл дистиллированной, воды и этой смесью окрашивают мазки в течение 30 — 40 мин. После этого ополаскивают водой, дифференцируют 0,1 % раствором соляной кислоты в абсолютном спирте, ополаскивают в абсолютном спирте и заключают в бальзам.

Результат: бактерии окрашиваются в малиново-красный цвет.

Окраска генциановым или метиловым фиолетовым

Для ориентировочной окраски бактерий можно воспользоваться также карболовым генциановым фиолетовым или кристаллическим фиолетовым. Однако эти красители при дифференцировке 70 0 спиртом легче извлекаются из клеточных элементов и бактерий, чем фуксин, поэтому, пользуясь ими, рекомендуется сильно перекрашивать.

Смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового (генцианвиолет) со 100 мл 2,5 % раствора фенола (смесь хранится долго). Мазки окрашивают в течение 2 — 5 мин через фильтровальную бумагу, промывают в проточной воде, сушат и исследуют при масляной иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в густо-фиолетовый цвет.

Окраска карболовым тионином Николя

Смешивают 1 часть насыщенного спиртового раствора тионина с 10 частями 1 % водного раствора фенола, мазки окрашивают 3 — 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 30 секунд в 96 % спирте, снова ополаскивают в воде и высушивают. Препарат изучают при масляной иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в темно-синий цвет.

Окраска по Граму

Красящие растворы.

Раствор кристаллического фиолетового по Эрлиху: 1,2 г кристаллического фиолетового растворяют в 12 мл 96 % спирта и добавляют 100 мл свежеприготовленной анилиновой воды, полученной при смешивании 2 мл анилина со 100 мл воды. Эта красящая смесь может храниться 2 нед. Вместо кристаллического фиолетового можно использовать метиловый фиолетовый.

Красящие смеси для грамположительных бактерий:

1) 10 г кристаллического фиолетового + 100 мл спирта;

2) 10 г генцианового фиолетового +100 мл спирта;

3) 10 г метилового фиолетового + 100 мл спирта;

4) 1 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового + 10 мл дистиллированной воды;

5) 0,25 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового +100 мл 5 % раствора уксусной кислоты;

6) 8 — 9 г метиленового синего +100 мл спирта;

7) 30 мл насыщенного раствора метиленового синего в спирте + 1 г гидроксида калия + 99 мл дистиллированной воды.

Красящие смеси для грамотрицательных бактерий:

1) 8 — 9 г основного фуксина + 100 мл 96 % спирта;

2) 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина + 10 мл дистиллированной воды;

3) 1 г основного фуксина +1 г фенола + 0,5 мл глицерина + 10 мл 96 % спирта +100 мл дистиллированной воды;

4) 0,2 — 0,5 % водный раствор сафранина либо 0,25 % раствор сафранина в 10 % спирте.

Методика окраски.

1. Мазки крови, цереброспинальной жидкости, экссудатов фиксируют над пламенем горелки (быстро проводят 3 раза над пламенем, так чтобы мазок прогревался до 70-80 0 С в течение 3-4 с), затем высушивают. Кроме фиксации над огнем, для мазков применима фиксация в метиловом спирте (5 мин) или в парах формалина (в сосуде Коплина) в течение 15 мин.

2. Наливают на фиксированный мазок карболовый или анилиновый генциановый фиолетовый (или кристаллический фиолетовый) на 2—3 минуты. Во избежании осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. Очень удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно пропитанной 1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и затем высушенной. Такую окрашенную и высушенную бумагу накладывают на мазок и смачивают дистиллированной водой. Продолжительность окрашивания остается прежней (2—3 мин.).

3. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу и быстро споласкивают в водопроводной воде (15—30 секунд).

4. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя иди другим йодистым раствором, например по Граму (2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода, доливают до 300 мл, а по Вейгерту до 100 мл дистиллированной воды).

5. Раствор сливают, мазок промывают водой (водопроводной или дистилированной).

6. Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-40-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают.

Если вместо спирта использовать ацетон, то промывание продолжается 30 с. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.

7. Промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1 — 2 мин.

8. Дополнительно окрашивают (для выявления грамотрицательной группы бактерий) либо 0,5% водным раствором нейтрального красного (нейтральрот), либо разведенным (в 10 раз) карболфуксином Циля — 1-2-3 минуты. Возможна докраска сафранином (0,2-0,5 % водный раствор или 0,25 % раствор в 10 % спирте) основным коричневым (бисмаркбраун) либо пиронином J или В (2-5 мин).

9. Промывают в проточной воде 5 с и высушивают фильтровальной бумагой.

Результат: Грамположительные бактерии окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, грамотрицательные — в красный или коричневый в зависимости от красителя; ядра клеток — ярко-красные, цитоплазма — розовая.

Следует заметить, что в классической прописи при окраске по Граму обычно не промывают мазки в воде ни после окраски генциановым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни после обработки раствором Люголя, ограничиваются лишь сливанием растворов. Предлагаемое промывание в воде имеет целью только чистоту в работе, тем более, что оно ни в какой мере не отражается на результатах окрашивания.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Приготовление красителя

Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 — 25 минут при 37 0 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.

Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.

Методика окраски

1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 — 6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного плазмодия — 7,0 — 7,2.

2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный.

Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)

Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые после окрашивания фуксином не обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот и спиртов. Особенностью этой группы бактерий является их невосприимчивость к красителям, поэтому для их окрашивания применяют подогретые концентрированные красители. Наиболее распространен метод Циля-Нильсена.

Окраска микобактерий туберкулеза карбол-фуксином по Цилю-Нильсену

Приготовление красителя

Для приготовления раствора карболового фуксина 1 г основного фуксина растворяют в 2 мл глицерина и доливают до 100 мл 5 % раствором фенола. Р. Лилли (1969) рекомендует следующую пропись: в 50 мл спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить дистиллированной водой до 500 мл.

Методика окраски

1. Наливают на фиксированный мазок карбол-фуксин Циля (окрашивают через фильтровальную бумагу) и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживают в течение 1—2 минуты, не доводя до кипения.

2. Сливают краску, удаляют фильтровальную бумагу и основательно промывают в водопроводной воде.

3. Дифференцируют 1% солянокислым спиртом (на 70° спирте) до тех пор, пока мазок не примет бледно-розовый или бледно-фиолетовый тон (примерно 30—60 секунд).

4. Промывают в воде 15-30 и более секунд.

5. Докрашивают метиленовым синим Лефлера 15-30 секунд.

6. Основательно споласкивают в воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Мазки, перекрашенные метиленовым синим, можно дифференцировать 70° спиртом.

Такое простое окрашивание мазков на микобактерии туберкулеза практически имеет наибольшее значение. Наряду с ним, но значительно реже, применяются и другие способы: метод обогащения, посевы, прививки животным.

Результат: микобактерии окрашиваются в красный цвет на общем голубом или синем фоне.

Источник

2. Рецепты приготовления красок и реактивов для окрашивания бактериальных препаратов

Принцип приготовления насыщенных спиртовых растворов красок

В основе приготовления многих красящих растворов лежит предварительное получение насыщенных спиртовых растворов красок, способ изготовления которых в принципе одинаков для всех красителей.

Порошки красок в определенном для каждого красителя количестве (указанном ниже) высыпают во флаконы, заливают 96 % этиловым спиртом и ставят на 18–24 ч в термостат с 37 °С, периодически взбалтывая.

В течение указанного времени значительная часть краски растворяется, оставляя только на дне флакона небольшой осадок.

Насыщенные растворы красок могут храниться долгое время во флаконах темного стекла со стеклянными притертыми крышками или резиновыми пробками.

Принцип приготовления рабочих спиртоводных растворов красок

Спиртоводные растворы красок готовят из насыщенных спиртовых растворов. Для этого в небольшое количество насыщенного спиртового раствора краски добавляют дистиллированную воду в разных соотношениях (в зависимости от красителя).

Рецепт 7. Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего

Метиленовый синий 8,0–9,0 г

Этиловый 96 % спирт 100 мл

Краска при периодическом помешивании должна настояться при комнатной темп

Рецепт 8. Спиртоводный раствор метиленового синего

Метиленовый синий насыщенный
раствор (8–9 %) 1 мл

Этиловый 96 % спирт 10 мл

Дистиллированная вода 100 мл

Рецепт 9. Щелочные растворы метиленового синего Леффлера

Дистиллированная вода 100 мл

10 % раствор гидроксида калия 2 капли

Насыщенный 7 % раствор
метиленового синего 30 мл

ературе или в термостате.

Пропись 2
Метиленовый синий 3,0 г
Этиловый 96 % спирт 20 мл
1 % раствор гидроксида калия
(КОН) 1 мл

Дистиллированная вода 100 мл
Перемешать в указанном порядке перечисленные выше ингредиенты. Краска должна быть подвергнута «созреванию», которое протекает в течение нескольких месяцев. Процесс «созревания» может быть ускорен при аэрации раствора. Для этого посуду заполняют краской не более чем наполовину, вместо пробки используют рыхлый ватный тампон. Содержимое флакона должно часто перемешиваться. Во время хранения свойства краски улучшаются.
Щелочные растворы метиленового синего устойчивы и могут храниться во флаконе со стеклянной или резиновой пробкой длительное время, не изменяя своих свойств.

Рецепт 10. Синька Нейссера

Готовят отдельно два основных раствора.

Метиленовый синий 0,1 г

Этиловый 96 % спирт 2 мл

Ледяная уксусная кислота 5 мл

Дистиллированная вода 100 мл

Кристаллический фиолетовый
насыщенный спиртовой раствор 1 мл

Этиловый 96 % спирт 10 мл

Дистиллированная вода 300 мл

Для окраски зерен валютина непосредственно перед окраской смешивают 2 части первого раствора с 1 частью второго раствора.

Метиленовый синий 0,1 г

Этиловый 96 % спирт 5 мл

Ледяная уксусная кислота 5 мл

Дистиллированная вода 100 мл

Хризойдин или везувин 1,0 г

Дистиллированная вода 300 мл

Краску растворяют в кипящей воде и фильтруют через бумагу. Для приготовления рабочего раствора непосредственно перед применением смешать 2 части раствора первой краски и 1 часть раствора второй краски.

Рецепт 11. Водный раствор метиленового синего

Метиленовый синий 1,0 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Применяется для ориентировочной окраски препаратов, при окраске по Цилю–Нильсену кислотоустойчивых бактерий, дает отчетливо окрашенные клетки микроорганизмов на нежно-голубом фоне.

Кристаллический фиолетовый всегда может быть заменен генциановым или метиловым фиолетовым, поскольку эти красители относятся к одному классу химических соединений, очень близки по структуре, составу химической формулы и имеют совершенно одинаковый эффект окраски.

Рецепт 12. Насыщенный спиртовой раствор кристаллического фиолетового
Кристаллический фиолетовый 8,0–10,0 г
Этиловый 96 % спирт 100 мл

Рецепт 13. Спиртоводный раствор кристаллического фиолетового
Насыщенный спиртовой раствор
кристаллического фиолетового 1 мл
Дистиллированная вода 10 мл
Раствор нестойкий, готовится на 1–2 дня

Рецепт 14. Карболовый раствор кристаллического фиолетового
Пропись 1
Кристаллический фиолетовый 1,0 г
Фенол кристаллический 2,0 г
Этиловый 96 % спирт 10 мл
Дистиллированная вода 100 мл
Карболовый раствор кристаллического фиолетового 1 г растирают в фарфоровой ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями приливают спирт. После того как краска хорошо разотрется, приливают при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Краска нестойкая.
Пропись 2
Насыщенный спиртовой раствор
кристаллического фиолетового 10 мл
Фенола 2 % водный раствор 100 мл
Полученную смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор краски нестойкий, в прок не готовится.

Рецепт 15. Фуксина насыщенный спиртовой раствор

Основной фуксин 8,0–9,0 г

Спирт 96 % этиловый 100 мл

Рецепт 16. Фуксина спиртоводный раствор

Насыщенный спиртовой раствор
фуксина 1 мл

Дистиллированная вода 10 мл

Спиртоводный раствор фуксина нестойкий, поэтому готовят его ex tempore перед окраской препаратов.

Рецепт 17. Фуксин карболовый Циля

Основной фуксин в порошке 1,0 г

Фенол кристаллический 5,0 г

Этиловый 96 % спирт 10 мл

Дистиллированная вода 100 мл

1 г основного кристаллического фуксина растирают в фарфоровой ступке с 5 г кристаллического фенола и несколькими каплями глицерина. Во время растирания фуксина с фенолом небольшими порциями добавляют спирт. После того как краска хорошо разотрется, приливают при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой пробкой.

Насыщенный спиртовой раствор
основного фуксина 10 мл

5 % раствор карболовой
кислоты 90 мл

Карболовую кислоту вливают в краску! Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют через влажный бумажный фильтр, после чего сливают во флакон темного стекла для хранения.

Рецепт 18. Фуксин Пфейффера
Карболовый фуксин Циля 1 мл
Дистиллированная вода 9 мл
Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. Полученный раствор краски очень нестойкий, поэтому его готовят в небольших количествах только для работы на текущий день.

Красители и реагенты для окраски по Граму в модификации Г.П.Калины
Рецепт 19. Бриллиантового зеленого спиртовой раствор
Бриллиантовый зеленый 0,05 г
Этиловый 96 % спирт 10 мл
Краска хранится длительное время во флаконе темного стекла, в темноте, закрытая стеклянной притертой или резиновой пробкой.

Рецепт 20. Основной реактив Калины для окраски нейссерий по Граму
5 % раствор основного фуксина
Циля 2 мл
5 % раствор спиртового раствора
йода 2 мл
0,5 % спиртовой раствор
йодида калия 96 мл
0,5 % раствор йодида калия готовится при подогревании на водяной бане. После полного растворения навески йодида калия в 96 % спирте последний соединяют с растворами фуксина и йода. Полученную смесь хранят во флаконе темного стекла с притертой пробкой в холодильнике.

Приготовление красящих бумажек по Синеву

Для приготовления красящих бумажек пользуются стандартной фильтровальной бумагой, которую предварительно испытывают на пригодность. Для этого отрезают полоску бумаги и погружают в спиртовой раствор красителя, затем высушивают на воздухе. Хорошая бумага окрашивается равномерно, без пятен. Затем от нее отрезают небольшой кусок и кладут на стекло с несколькими каплями воды. Пригодная для окраски бумага сразу пропитывается водой и через несколько секунд «отдает» краситель, вследствие чего вода вокруг становится интенсивно окрашенной в соответствующий цвет. Если этого не происходит, бумага для приготовления красящих бумажек непригодна.

Техника приготовления красящих бумажек. Краситель, предназначенный для пропитывания бумаги, наливают в лоток или глубокую тарелку. Бумагу нарезают в виде полосок шириной 2–2,5 см и длиной 30–50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краситель так, чтобы смачивались обе ее поверхности. Окрашенные полосы вынимают пинцетом, дают красителю стечь и подвешивают на веревке для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре или в термостате при 37–50 °С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2×2 или 2×4,5 см.

Рецепт 26. Прописи растворов красителей для приготовления бумаги

Кристаллический генциановый или метиловый фиолетовый для окраски по Граму

Кристаллический фиолетовый 1,0 г

Этиловый 96 % спирт 100 мл

Пропись обычная: на 100 мл приготовленного красителя добавляют 1–2 мл глицерина

Источник