Как приготовить раствор кумасси g250

Содержание

Как приготовить раствор кумасси g250
Как приготовить раствор кумасси g250
Как приготовить раствор кумасси g250

Как приготовить раствор кумасси g250

Ещё один протокол с Coomassie brilliant blue G-250

после SDS-PAGE гель отмывается 5′ в воде или согласно стандартной процедуре;
перенести гель в Staining solution, в свежем растворе инкубировать при покачивании минут 5-10;
окрашивается 5-30′, в крайнем случае 60′ (при длительной инкубации придется долго отмывать гель);
промыть водой, а если передержали гель в красителе, то можно убыстрить процесс 7% уксусной кислотой;
гель либо фотографировать, либо сушить.

Staining solution (хранить при NT в плотно закрытой посуде)

Coomassie G-250	0.05%
Трихлоруксусная кислота	2%
Этанол или метанол	20%

Кумасси растворяется в спирте, затем добавляется вода и медленно, при перемешивании, TCA stock solution (10-100% по желанию). Готовый продукт не содержит никаких нерастворившихся частиц. Используется многократно.

Похожий протокол присылала Инна Кригер. Раствор Инны основан на хлорной кислоте, подобный ему мы много лет использовали в нашей лабе. Также подобный продается Сигмой (#B8872 Brilliant Blue G-Perchloriс acid solution).
Мой протокол основан на TCA и схож с сигмовским #B4523 Brilliant Blue G-TCA solution (0.08% Brilliant Blue G in 12% TCA, pH has been adjusted with H₂SO₄ and KOH to remove insolubles), но еще содержит спирт и не нуждается в доводке рН.
Кроме того, Сигма продает коллоидальный раствор — #B2025 Brilliant Blue G-Colloidal Concentrate (0.1% G, 0.29M H₃PO₄, 16% sat. (NH₄)₂SO₄. Pierse продает Gel Code Blue Stain reagent (sensitivity 8 ng) и BioRad — BioSafe Coomassie Stain (8-28 ng). Я сравнивал свой раствор с двумя последними и не нашел различий в окрашивании (кроме скорости окраски).

Вообще-то нужно указывать по какому белку проверялась чувствительность. Например, я прежде работал с запасными глобулинами семян, так окрашивание серебром не увеличивает чувствительности. Если работать с грубыми экстрактами, то некоторые бэнды окрашиваются лучше в кумасси. Ещё я сравнивал окрашивание альбуминовой фракции экстрактов семян по серебру (кит Bio-Rad) с моим раствором, так серебро было чувствительнее где-то в 2-5 раз всего-навсего.

При хранении в воде при комнатной температуре гель быстро зарастает, лучше ставить в холодильник.

Дополнения, комментарии, вопросы

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/

Источник

Как приготовить раствор кумасси g250

окрашивать в Staining solution 2-4 часа;

Отмывка от несвязавшегося красителя.

(*) — удобно добавлять этанол отдельно (непосредственно перед использованием).
Кумасси очень плохо растворяется в данных условиях. Он может не раствориться полностью или при окрашивании начать выпадать на стенках и на поверхности геля — это нормально. Фон уйдет при отмывке.

Достоинства метода:

довольно высокая чувствительность (обычно заявляется 5-10ng на пятно, то есть на порядок меньше, чем у окраски серебром, но раз в 5 выше, чем у стандартного окрашивания Coomassie R250);
простота;
низкий фон;
отличная совместимость с масс-спектрометрией;
по сравнению с коммерческими растворами коллоидного кумасси — значительно более низкая цена.

Найти первоисточник именно этого протокола уже не представляется возможным. В таком виде, как здесь, протокол представлен, например, на сайтах proteomics.missouri.edu или proteomics.uchsc.edu.

Очень важно хорошо отмыть от SDS!

Если белки очень мелкие и легко вымывающиеся из геля или вы работаете с большими (2D) гелями: предпочтительнее вместо отмывки водой фиксировать гель в теченийе часа в любом стандартном фиксаторе (этанол/ацетате, этанол/ фосфорная кислота, и т.п.)

Я использую G250 от Sigma — у них порошок называется «brilliant blue G», код #B-0770 пятиграмовая банка стоит около 40 Евро.

Окраска начинает проявляться где-то минут через 30; развитие окраски видно глазом, так как фон остается практически прозрачным.

После отмывки нельзя долго хранить гель в воде, так как происходит дальнейшее отмывание.

Дополнения, комментарии, вопросы

Здесь лежит статья с усовершенствованием этого метода http://newjournal.kcsnet.or.kr/main/j_sear. tm?code=B021105 ( http://newjournal.kcsnet.or.kr/main/j_search/j_download.htm?code=B021105 )

Описаный в статье реагент продает Pierce как «Gel code Blue».

Коллоидная окраска хорошо работает только на тонких и сверхтонких гелях (0.5 mm и тоньше, типа PhastGel), для 0.75-1 мм лучше применять краску такого состава:

5 мг Кумасси R-250
10 мг Кумасси G-250
10 мг Amido black
——————
100 ml 10% Уксусной кислоты

Гель разбухает при окраске, что обеспечивает лучшую диффузию краски внутрь, при отмывке в 5% уксусной/20% метанол он возвращается к обычному размеру.

Стандартный способ с 10-20% сульфатом аммония у меня работал нестабильно. Я титровал разок БСА, было видно 5 нг, как, примерно, видно 50нг при обычном R-250.
Обычно использовал коллоидное Кум.после окрашивания стандартным способом с R-250 для усиления окраски слабых полос, но красить надо сутки, помогало.

Самая свежая статья по этому методу:
G.Candiano et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis 2004, 25, 1327–1333.
http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin. 565269/ABSTRACT ( http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/108565269/ABSTRACT )

Делаю как в статье, только метанол заменяю на этанол — работает хорошо. Но полгода не хранится. проверено.

Это — калька SympleBlue Microwave Protocol from Invotrogen (1,0 и 1,5мм минигели) ©

Пологаю, для него подойдет раствор любого коллоидного кумасси — я делал это с био-радовским 161-0786. Итак:

1. Поместить гель в 100мл ультра-чистой воды и греть в микроволновке при 950-1100Вт —— 1 минута.
2. Покачать гель на орбитальном шейкере и
слить воду —— 1 минута.
3. Дважды повторить этапы 1 и 2 —— каждого по 1 минуте.
4. Добавить 20-30мл коллоидного кумасси и погреть в микроволновке при 950-1100Вт —— 45-60 секунд.
5. Покачать на орбитальном шейкере.
Слить краску —— 5-10 минут.
6. Мыть гель покачиванием в 100мл ультрачистой
воды —— 10 минут.
7. Влить в воду 20мл 20%NaCl и качать —— 5-10 минут.
(8. При желании повторить этап 6, чтобы убрать
фон —— 1 час).

Еще отсебятина: жидкости буквально кипят, но 3%ПААГ или градиентный 3-8%ПААГ остаются целыми, чуствительность неплохая — я красил после трансфера/20 часов и, к своему удивлению, что не все перенеслось. Надеюсь, это те 5нг, про которые пасали на фирме. А фон белый-белый.

У меня вопрос, а кто пробовал растворит обычный (не пудра-образный) сульфат аммония в фосфорной кислоте? Сколько это может времени занять? Я на шейкер поставил, уже час плюхается, но эффекта не заметно. Пробую наваять http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin. 565269/ABSTRACT ( http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/108565269/ABSTRACT ) но 13гр соли не хочет растворяться в 13мл эсида.

Народ, коллоидом никто не красит чтоли?

Написано, что после отмывки нельзя долго хранить. Некоторые гели месяцами валяются забытыми в холодильнике, под сантиметровым слоем обычного дистиллята. И все полосочки видно как на свежепрогнанном.

-Народ, коллоидом никто не красит чтоли?
Я другим протоколом красил там ТХУК и сульфата и фосфорки нет.

—под сантиметровым слоем обычного дистиллята.
Это зря лучше все же в уксусе низкомолекулярные белочки размываются в водице, а то и совсем из геля выходють.

-Написано, что после отмывки нельзя долго хранить.
Может коллоидный кумаси легко отваливается от геля, не знаю.

12.5kDa. Сидят как вкопанные.

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/

Источник

Как приготовить раствор кумасси g250

Окрашивание белковых гелей Coomassie brilliant blue R250

5V Staining solution на

4h (лучше с покачиванием);

убрать Staining solution (его можно использовать несколько раз);

быстро сполоснуть гель H 2 O;

отмывать в двух сменах Destaining solution:

Destaining solution I

20′-2h (в зависимости от температуры),
Destaining solution II

альтернативный метод отмывки (Дмитрий Жарков)
4. гель кладется в широкую стеклянную посудинку с холодной водой (200-300 ml), и кипятится

5′ (или до желаемой прозрачности);

ещё один вариант (Gottfried Willharm)
4. при отмывке (не важно, в Destaining solution или при кипячении в воде) накидать в сосуд для отмывки мелко рваной бумаги (фильтровалки или туалетной). Чистой, разумеется. При этом за счйет сорбции R-250 на бумаге уменьшается фон и скорость отмывки значительно возрастает. Фактически, это удобный аналог двухфазного раствора.

гель либо фотографировать, либо сушить.

Чувствительность: 0.1-1.0µg белка на бэнд.

Метод не очень чувствителен, и вполне возможно работать с гелем без перчаток. Но мы не советуем этого делать, если Вам не хочется, чтобы в транспорте косились на Ваши синие пальцы.

При окрашивании фон возникает из-за SDS и буфера, если их предварительно отмыть фон получится существенно слабее:

* отмыть гель в 2 х сменах большого объёма 5mM HCl (каждая смена

1h);
* далее — окраска как обычно.

Скорость окрашивания зависит от температуры. При 60-65 o С достаточно Внимание (. ) горячее окрашивание можно проводить только под тягой: пары метанола сильно ядовиты.

Отмывка идет существенно быстрее при повышенной температуре. Но(!) при этом за ней нужно следить, иначе можно смыть не только фон, но и специфический сигнал (если всё же не уследили, окрашивание можно повторить). Внимание (. ) горячую отмывку можно проводить только под тягой: пары метанола сильно ядовиты.

Бутанол вытягивает краситель из водной фазы. Двухфазный Destaining solution гораздо удобнее, чем однофазный или двухфазный с поглотителями. Отмывка существенно быстрее, раствор служит гораздо дольше.

Destaining solutions I и II различаются только названиями. Destaining solution I применяется первым (предварительная отмывка), он более грязный. Destaining solution II (финальная отмывка) — чище. Когда бутанол в Destaining solution I становится совсем грязным, его выбрасывают (удобнее отсосать вакуумным насосом); на его место переливают бутанол из Destaining solution II, который, в свою очередь, заменяют свежим бутанолом (или просто переобозначают раствор «II» в «I»).

Удобство в том, что без уксусной, без метанола, и гораздо быстрее. Результат — как при стандартной отмывке, может, фон чуть погуще. Растрескивание при сушке обычное. Мы так отмываем уже года два, оригинальная ссылка на: G.Hervieu. A quick and safe method for destaining Coomassie-Blue-stained protein gels. Technical Tips Online.

Обычно гель сушат (т.к., если человек умеет фотографировать, то лучше пользоваться Zn/имдазол методом: он существенно быстрее и чувствительнее).

Есть два пути решения проблемы растрескивания гелей при сушке (обычно это касается только высокопроцентных гелей):

инкубировать гель перед сушкой или

1h в 20% глицерине, или

30′ в ацетоне.

использовать более мощный вакуумный насос.

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/

Дополнения, комментарии, вопросы

Перед окрашиванием гель прокипятить 3 мин. в дистиллированной воде, в микроволновке. Так можно быстро удалить значительное количество SDS из геля, что позволит уменьшить фон и сократить время окрашиывния.

БЫСТРЫЙ СПОСОБ ОКРАСКИ!

Главное его преимущество — то, что через час Вы уже сможете узнать о том, что Ваш белок опять не там (или там, если повезло)
Ну, и реактивы без всякого особо ядовитого метанола. Спирт, уксус.

Краситель: 0,22% (масс/об) Кумасси G-250, 40% (об/об) этанол, 8% (об/об) уксусная кислота.

Гель залить красителем, нагреть до появления пара (на горелке или в микроволновке — у кого что есть) , под крышкой оставить минут на 15, после чего краситель слить обратно в колбу (он работает долго без замены). Гель отмывать от фона кипячением в нескольких сменах воды (из-под крана или дистиллята, это не очень принципиально) до исчезновения окраски фона и проявления полос белка.

спасибо!
только это к другой страничке, где окраска с использованием G-250

Можно все это проделать быстрее и безопаснее

1. 10-15 минут в 10% Укс.к., 40% этанол — фиксация
2. 20 мин. в 0.4% Coomassie Blue R250, 10% Укс.к., 40% этанол — окрашивание
3. 20 мин. в 10% Укс.к. — отмывка (если белка много то и после первых минут видны полосы)

С Кумасси R-250 мы красим так.
За 10 мин. до окончания фореза ставится кастрюлька с водой на плитку. К моменту окончания фореза она закипает. Гель кидается в стакан, заливается раствором следующего состава: этанол — 300мл, вода — 300мл, ледяная уксусная к-та — 60мл, кумасси R250 — 0,7г. Наливать не очень много, но так, чтобы гель свободно болтался в жидкости. Кипятим стакан на водяной бане — 10мин. Краску сливаем (ее можно использовать многократно), ополаскиваем гель в стакане водой, заливаем 7%уксусом (столько же, сколько и краски) и кипятим 3-5 мин. Меняем уксус, снова кипятим. После 3й смены гель гарантированно отмывается. Все делать под тягой. Кипятить с краской обязательно на водяной бане, иначе она будет плеваться во все стороны

микроволновка, безусловно, много лучше, если налит немного, то пару минут- и уже все почти кипит, только следить, чтоб гель не скукожился, и будет хорошо

А что, помыть в горячей воде (те использую слово кипяток, ибо риск) перед окрашиванием снижает фон?

Кто нибудь знает как сделать коричневый раствор кумаси (как в «Bio-Rad Bio Safe Commassie»)?

Красится и отмывается без кипячения за 20 мин.

у меня была ссылка на протокал в статье 70х или 80х годов.

colloidal coomassie — в гугле

Несколько «заметок на полях»
С G-250 — коллоидный раство получают, постепенно примешивая раствор красителя к 10% ТХУ, получается эдакая смесь цвета хаки. Фон, действительно, слабее, но и чувствительность ниже — потому что окрашиваются белки только на поверхности геля, а не по всей толще, т.к. колллоидный раствор плохо проникает.

Если готовить раствор красителя не с этанолом, а изопропанолом, то SDS диссоциирует быстрее и фиксация происходит лучше. К тому же лучше, чем при стандартной процедуре, окрашиваются гликопротеиды.

А для хорошей отмывки, не распространяя вокруг себя аппетитные пары уксуса с этанолом удобно погрузить белок в отмывочный раство с 10% глицерином — гель сжимается и белеет, при возвращении в нормальную среду восстанавливается в размерах, но фон гораздо ниже (личное наблюдение ).
Убирать краску можно легко, добавляя в отмывочный раствор куски поролона — замечательно экстрагирует кумасси.

ОЧЕНЬ БЫСТРЫЙ МЕТОД ОКРАШИВАНИЯ (10-15 МИНУТ. )

Граждане, все можно сделать еще проще и быстрее. При окрашивании геля Кумасси R-250 довести раствор краски с положенным в него гелем до кипения в микроволновке (это буквально одна минута) и все. Никакая фиксация не нужна, белки фиксируются уже в краске.

Дальше можете уже отмывать в воде при кипении. Налейте в пластиковую коробочку для микроволновки воду (побольше) и доведите до кипения (минуты 3). Кипятить не надо, можно отмыть нужную полосу. Набросайте фильтровальную бумагу (любую, которую не жалко, хоть туалетную) и покачивайте, пока синий фон из геля не перейдет в бумагу. Затем воду смените и процедуру повторите. Все! Окрашивание закончено! На все-про-все — 10-15 минут!

Если хотите удалить из геля SDS (чтобы раствор краски после использования можно было хранить и использовать бесконечно долго), вместо обычной процедуры фиксации, наверное, можно попробовать кипятить гель в воде до окрашивания, как предлагалось выше. Никогда не пробовала, однако, метод кажется вполне разумным.

Можно ли в рецептуре метанол заменить этанолом?

так и надо, жить спокойнее и проще, результат тот же

Ну просто в хроматографии и методах мокрой химии этанол и метанол — далеко не одно и то же, так что не хотелось бы на собственной шкуре шишки набивать
НУ раз «все юзают этанол», а ето в отличии от метанола у меня практически неограничено, бум его лить

Источник