Как приготовить раствор ларионова

Принцип метода . В основу положена кольцевая проба Геллера, заключающаяся в том, что при добавлении к моче азотной кислоты на границе сред (кислота—моча) при наличии белка происходит его коагуляция, и появляется белое кольцо.

Реактивы : 30% раствор азотной кислоты (HNO₃) (d = 1,2) или реактив Ларионовой: 20–30 г натрия хлорида (NaCl) растворяют при нагревании в 100 мл дистиллированной воды, остужают, фильтруют; к 99 мл фильтрата приливают 1 мл концентрированной HNO₃.

Ход определения . В пробирку наливают 1–2 мл 30% раствора HNO₃ или реактива Ларионовой и осторожно по стенке наслаивают столько же профильтрованной мочи.

Оценка результатов . Появление на границе двух жидкостей между 2-й и 3-й минутами тонкого белого кольца указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. При появлении кольца раньше 2 мин после наслаивания мочу следует развести дистиллированной водой и провести повторное исследование с разведенной мочой. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся ранее 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком — в 4 раза, при компактном — в 8 раз и т. д. Концентрацию белка вычисляют, умножив степень разведения на 0,033 г/л.

Примечание . Белое кольцо может образовываться при наличии больших количеств уратов; в отличие от белкового, оно появляется немного выше границы двух жидкостей и растворяется при легком нагревании.

Источник

Определение белка в моче методом Брандберга – Робертса – Стольникова

Метод Брандберга–Робертса–Стольникова относится к полуколичественным методам определения общего белка в моче. В основу метода положена кольцевая проба Геллера, заключающаяся в том, что на границе азотной кислоты и мочи при наличии белка происходит его коагуляция и появляется белое кольцо.

Реактивы

50% раствор азотной кислоты или реактив Ларионовой.
Приготовление реактива Ларионовой: готовят насыщенный раствор хлорида натрия (20 – 30 г соли растворяют в 100 мл воды при подогревании, дают отстояться до охлаждения). Надосадочную жидкость сливают, фильтруют. К 99 мл фильтрата добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты. Вместо азотной кислоты можно добавить 2 мл концентрированной соляной кислоты.

Ход определения

В пробирку наливают 1 – 2 мл азотной кислоты (или реактива Ларионовой), дают кислоте стечь со стенок пробирки (5 – 8 минут), иначе при наслаивании белковой мочи образуется муть вследствие смешения азотной кислоты на стенках пробирки с мочой, что мешает образованию отчетливого кольца. Поэтому следует предварительно приготовить серию пробирок с кислотой. Пипеткой осторожно по стенке пробирки наслаивают такое же количество профильтрованной прозрачной мочи, стараясь не взбалтывать жидкость в пробирке. Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2-й и 3-й минутой указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. Время наслаивания считают за четверть минуты.

Если кольцо появляется раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т. е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся раньше 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком – в 4 раза, при компактном – в 8 раз и т. д. Разведение мочи делают в мерной центрифужной пробирке, наливая мочу до метки 1 мл и доливают водой до той метки, во сколько раз делается разведение. Содержимое пробирки тщательно перемешивают пастеровской пипеткой с баллоном. Если при разведении мочи появляется муть, то смесь нужно вновь отфильтровать и только прозрачный фильтрат наслаивать на азотную кислоту. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на литр (г/л). Подбирают такое разведение мочи, чтобы при наслаивании ее на азотную кислоту кольцо появилось на 2 – 3-й минуте.

В случае, если с неразведенной или разведенной мочой кольцо образуется между 1-й и 4-й минутой, можно пользоваться поправкой Эрлиха-Альтгаузена, для того, чтобы не разводить мочу дополнительно (это экономит время). Авторы предложили определить время появления нитевидного кольца и внести в расчет поправку на время. В этом случае количество белка рассчитывают, умножая 0,033 г/л на степень разведения и на поправку.

Значения поправок для определения белка

Время образования кольца, мин	Поправка
1 – 1 1 /₄	1 3 /₈
1 1 /₄ — 1 1 /₂	1 1 /₄
1 1 /₂ — 1 3 /₄	1 3 /₁₆
1 3 /₄ — 2	1 1 /₈
2 — 2 1 /₂	1 1 /₁₆
2 1 /₂ — 3	1
3 — 3 1 /₂	15 /₁₆
3 1 /₂ — 4	7 /₈

При образовании кольца до истечения 1 минуты необходимо сделать одно дробное разведение, а именно в 1,5 раза (две части мочи и 1 часть воды). Это разведение также учитывается при расчете количества белка в моче.

Пример определения общего белка в моче методом Брандберга-Робертса-Стольникова.

При наслоении мочи на реактив сразу образуется широкое кольцо. Разводят мочу в 4 раза (1 часть мочи + 3 части воды), наслаивают; получается сразу нитевидное кольцо. Нужно имеющееся разведение развести еще в 2 раза; при наслаивании этого разведения образуется кольцо через 1,5 минут. Дальше можно не разводить.

Расчет белка: мочу развели в 4 и 2 раза, следовательно, в 8 раз. Количество белка равно 0,033*8*1 1 /₄ = 0,33 г/л

Недостатки метода Брандберга-Робертса-Стольникова:

субъективность,
трудоемкость,
снижение точности определения концентрации белка по мере разведения мочи.

Литература:

Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под ред. проф. В. В. Меньшикова. — Москва, «Медицина», 1987 г
Л. В. Козловская, А. Ю. Николаев. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. Москва, Медицина, 1985 г.
А. Я. Альтгаузен, «Клиническая лабораторная диагностика» — Москва, Медгиз, 1959 г.
А. Я. Любина, Л. П. Ильичева и соавторы, «Клинические лабораторные исследования», Москва, «Медицина», 1984 г

Методическая разработка практического занятия «Определение белка в моче» (1 курс)

Тема: Определение белка в моче.

Цель: Изучить исследование химических свойств мочи.

Изучить количественные и качественные методы определения белка в моче;

Изучить основные принципы работы с тест-полосками на автоматических анализаторах.

Тип занятия: практическое (6ч)

Студент должен знать:

Качественные пробы для определения белка.

Метод Робертса – Стольникова.

Определение белка 3 % ССК.

Биуретовый метод определения белка (ТХУ).

Диагностическое значение исследования показателей.

Студент должен уметь:

Подготовить рабочее место к исследованию мочи.

Приготовить реактивы, посуду и оборудование к исследованию.

Определять химические свойства мочи (белок в моче качественными и количественными методами).

Работать с бланочной продукцией (оформление бланков анализа).

Правильно интерпретировать полученные результаты исследования.

Средства достижения поставленной цели:

1. Работа с конспектами, учебной и специальной литературой.

2. Подготовка к практическим занятиям с использованием методических рекомендаций преподавателя, выполнение и оформление практических работ.

3. Работа с информационными средствами обучения на электронных и бумажных носителях.

Оборудование учебного кабинета и рабочих мест кабинета:

посадочные места по количеству обучающихся;

рабочее место преподавателя;

специализированная мебель и оборудование.

Технические средства обучения:

компьютеры для оснащения рабочего места преподавателя и обучающихся;

технические устройства для аудиовизуального отображения информации;

аудиовизуальные средства обучения (презентация, учебный видеосюжет).

Результатом освоения урока является:

Формирование практических профессиональных умений и первоначального практического опыта, в том числе профессиональными ( ПК ) и общими ( ОК ) компетенциями:

ПК 1.1 . Готовить рабочее место для проведения лабораторных общеклинических исследований.

ПК 1.2 . Проводить лабораторные общеклинические исследования биологических материалов.

ПК 1.3 . Регистрировать результаты проведенных исследований.

ПК 1.4. Проводить утилизацию отработанного материала, дезинфекцию и стерилизацию использованной лабораторной посуды, инструментария, средств защиты.

ОК 1. Понимать сущность и социальную значимость своей будущей профессии, проявлять к ней устойчивый интерес.

ОК 2 . Организовывать собственную деятельность, выбирать типовые методы и способы выполнения профессиональных задач, оценивать их эффективность и качество.

ОК 6. Работать в коллективе и команде, эффективно общаться с коллегами, руководством, пациентами.

ОК 9 . Ориентироваться в условиях смены технологий в профессиональной деятельности.

ОК 13. Организовывать рабочее место с соблюдением требований охраны труда, производственной санитарии, инфекционной и противопожарной безопасности.

I модуль. Теоретическая часть с элементами самостоятельной работы

Задание №1. Изучите и законспектируйте учебный материал в рабочие тетради.

М оча здорового человека обычно содержит менее 0,002 г/л и редко до 0,012 г/л белка и как правило такое содержание белка в моче называют «в виде следов» и общепринятыми (унифицированными) химическими методами в моче здорового человека не определяется.

Содержание белка в порциях мочи, собранной в разное время суток, может колебаться в значительных пределах.

П оявление белка в моче называется протеинурия.

В зависимости от суточной потери белка различают следующие степени протеинурии: умеренная — до 1 г; средняя — от 1 до 3 г; выраженная — более 3 г.

Существует два основных вида протеинурии:

Протеинурии, обусловленные заболеваниями мочевыводящих путей;

протеинурии, при поражениях (заболеваниях) почек.

Протеинурии, связанные с воспалительными процессами мочевыводящих путей, сопровождаются появлением в моче значительного количества лейкоцитов или эритроцитов, что, однако, не позволяет исключить одновременного попадания белка в мочу из почечной паренхимы; содержание белка редко превышает 1 г/л.

Почечная протеинурия в большинстве случаев связана с повышенной проницаемостью гломерул и делится на 2 группы :

К физиологической протеинурии относят случаи временного появления белка в моче, не связанные с заболеваниями:

после приема большого количества пищи, богатой не денатурированными белками (сырое мясо, сырые яйца);

при интенсивной мышечной работе (продолжительные походы, спортивные соревнования);

при приеме холодной ванны или душа;

при сильных эмоциональных переживаниях;

при эпилептических приступах.

Различают ортостатическую, или юношескую, протеинурию, встречающуюся у детей и подростков и проходящую с возрастом. В дифференциально — диагностическом отношении имеет практическое значение то, что ортостатическая альбуминурия обнаруживается нередко в период выздоровления после острого гломерулонефрита.

Патологическая почечная протеинурия может быть следствием органических заболеваний почек и других органов и систем: острые гломерулонефриты; хронические гломерулонефриты; острые пиелонефриты; хронические пиелонефриты; нефропатии беременных; различные заболевания, сопровождающиеся лихорадкой; выраженная хроническая сердечная недостаточность; а милоидоз почек; липоидный нефроз; туберкулез почки; геморрагические лихорадки; геморрагический васкулит; выраженная анемия; гипертоническая болезнь и др.

Задание №2. Перепишите и зарисуйте схемы лабораторных методов определения белка в моче.

Лабораторные методы определения белка в моче

Существуют качественные и количественные методы определения белка в моче, они основаны на коагуляции белка в объеме мочи или на границе сред (моча и кислота); при этом измерение степени коагуляции делает пробу количественной.

проба с 20% сульфосалициловой кислотой (унифицированная);

кольцевая проба Геллера (в настоящее время не используется);

обнаружение белка с помощью индикаторной бумаги (полосок) и тест-полосок.

унифицированный метод Брандберга-Робертса-Стольникова;

с 3% сульфосалициловой кислотой.

Качественные методы определения белка в моче

Задание №3. Определение белка в моче с помощью у нифицированной пробы с 20% сульфосалициловой кислотой

Принцип метода: основан на коагуляции белка в объеме мочи или на границе сред (моча и кислота)

Посуда, оборудование и реактивы:

20% сульфосалициловой кислоты (2-гидрокси-5-сульфобензойная кислота C ₇ H ₅ 0 ₆ S ).

3мл профильтрованной мочи

2 шт. химические пробирки

В две пробирки вносят по 3 мл профильтрованной мочи, в одну из них (опытную) прибавляют 6—8 капель сульфосалициловой кислоты. На темном фоне сравнивают обе пробирки.

Интерпретация полученных результатов:

Помутнение в опытной пробирке свидетельствует о наличии в моче белка — проба положительна.

Примечание. Мочу со щелочной реакцией перед исследованием подкисляют добавлением нескольких капель 10% раствора уксусной кислоты

Задание №4. Определение белка с помощью кольцевой пробы Геллера

Принцип метода: В основу положена кольцевая проба, заключающаяся в том, что при добавлении к моче азотной кислоты на границе сред (кислота – моча) при наличии белка происходит его коагуляция и появляется белое кольцо.

Посуда, оборудование и реактивы:

— реактивы: 30% раствор азотной кислоты ( HNO 3) ( d = 1,2) или реактив Ларионовой : 20— 30 г хлорида натрия ( NaCl ) растворяют при нагревании в 100 мл дистиллированной воды, остужают, фильтруют; к 99 мл фильтрата приливают 1 мл концентрированной HNO 3.

В пробирку наливают 1 — 2 мл 30% раствора HNO 3 или реактива Ларионовой и осторожно по стенке наслаивают столько же профильтрованной мочи.

Интерпретация полученных результатов:

Появление на границе двух жидкостей между 2-й и 3-й мин тонкого белого кольца указывает на наличие белка в моче.

Зарисуйте схему определения белка

Количественное определение белка

Принцип метода: В основу положена кольцевая проба Геллера, заключающаяся в том, что при добавлении к моче азотной кислоты на границе сред (кислота — моча) при наличии белка происходит его коагуляция и появляется белое кольцо.

Посуда, оборудование и реактивы:

Биологическая жидкость (моча);

Интерпретация полученных результатов:

Появление на границе двух жидкостей между 2-й и 3-й мин
тонкого белого кольца указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. При появлении кольца раньше 2-х мин после наслаивания мочу следует развести дистиллированной водой и провести повторное исследование с разведенной мочой. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, его ширины, компактности и времени появления.

При нитевидном кольце, появившемся ранее 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком — в 4 раза, при компактном — в 8 раз и т.д. Концентрацию белка вычисляют, умножив степень разведения на 0,033 г/л.

Белое кольцо может образовываться при наличии большого количества уратов; в отличие от белкового оно появляется немного выше границы двух жидкостей и растворяется при легком нагревании.

Задание №6. Определение количества белка в моче с 3 % сульфосалициловой кислотой

Принцип метода: Концентрация белка в моче пропорциональна помутнению, появляющемуся при его коагуляции сульфосалициловой кислотой

Посуда, оборудование и реактивы:

0,9% раствор хлорида натрия;

1% стандартный раствор альбумина — 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9% раствора NaCl в колбе емкостью 100 мл, а затем доводят до метки тем же растворителем. Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5% раствора азида натрия ( NaN 3). При хранении в холодильнике реактив стабилен в течение 2 месяцев.

В пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, добавляют 3,75 мл 3% раствора сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 5 мин пробу фотометрируют на ФЭКе при длине волны 590—650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете с длиной оптического пути 5 мм. Контролем служит проба, в которой к 1,25 мл мочи добавлено 3,75 мл 0,9% раствора хлорид е натрия. Концентрацию белка рассчитывают по калибровочному графику, для построение которого готовят разведения стандартного раствора альбумина (см. таблицу) . Из каждого полученного разведенного раствора берут по 1,25 мл и обрабатывают, как опытные пробы.

Приготовление разведений для построения калибровочного графика

Стандартный раствор, мл

0,9% раствор хлорида натрия, мл

Концентрация белка, г/л

Прямолинейная зависимость величины экстинкции и концентрации белка сохраняется до 1 г/л. При более высоких концентрациях белка пробу следует разводить и учитывать разведение при расчете.

При наличии в моче веществ, содержащих йод, могут быть получены ложноположительные результаты. Поэтому тест нельзя использовать у больных, принимающих препараты йода или прошедших исследование с применением йодсодержащих рентгеноконтрастных соединений. Ложноположительные J реакции при проведении исследования могут быть вызваны приемом сульфаниламидных лекарственных средств, больших доз пенициллина и при высоких концентрациях в моче мочевой кислоты.

Зарисуйте схему определения белка

Задание №7. Обнаружение в моче белка Бенс-Джонса

Принцип метода: основан на реакции термопреципитации

Посуда, оборудование и реактивы:

Реактив: 2М ацетатный буфер рН 4,9.

4 мл профильтрованной мочи смешивают с 1 мл буферного раствора и нагревают 15 мин на водяной бане при температуре 56°С.

Интерпретация полученных результатов:

При наличии в моче белка Бенс-Джонса уже в первые 2 мин появляется выраженный осадок.

При концентрации белка менее 3 г/л проба может быть отрицательна, что встречается довольно редко, так как обычно концентрация белка Бенс-Джонса в моче весьма значительна.

Наиболее достоверно выявление белка Бенс-Джонса осаждением при температуре 40—60°С. Однако в слишком кислой (рН менее 3,0) или слишком щелочной (рН более 6,5) моче, при низкой относительной плотности мочи и низкой концентрации бежа Бенс-Джонса (менее 3 г/л) осаждение может не происходить.

Зарисуйте схему определения белка

II модуль. Самостоятельная работа с исследовательским этапом

Задание №1. Изучите и законспектируйте приложение №1 « Обнаружение белка с помощью диагностических тест-полосок»

— Получите образцы биологической жидкости (мочи) у преподавателя, пронумеруйте образцы;

— Проведите исследование мочи с помощью диагностических тест-полосок;

— Оцените полученный результат (норма, патология). Предположите причину возникновения белка в моче.

— Результат запишите в бланки анализа, сдайте их преподавателю.

« Обнаружение белка с помощью диагностических тест-полосок»

Принцип. Белок изменяет цвет индикатора, нанесенного на полоску. Индикаторы упакованы в комплекте по 100 полосок, которые хранятся в плотно закрытом пенале, прохладном и сухом месте.

Правила работы с диагностическими тест-полосками

При работе с диагностическими тест-полосками необходимо соблюдать следущие правила:

— держать диагностические тест-полоски в плотно закрытых упаковках-пеналах;

— хранить пеналы в темном, сухом, прохладном месте при температуре, не превышающей 30ºС, но не в холодильнике;

— не подвергать полоски действию влаги и прямого солнечного света, высокой температуры и летучих химических веществ;

— доставать только строго необходимое количество полосок, после чего немедленно закрывать пенал;

— не дотрагиваться пальцами до диагностических зон.

Правила проведения теста

1. Для исследования используйте утреннюю мочу, собранную в одноразовый пластиковый контейнер для мочи (или чистую сухую посуду). Перемешайте доставленную мочу, но не центрифугируйте.

При использовании нестандартной приспособленной тары остатки моющих средств в посуде для сбора мочи являются причиной ложных результатов.

2. Из пенала возьмите тест-полоску.

3. Сразу же закройте пенал фабричной крышкой, полоску охраняйте от влаги.

4. Индикаторные бумажные зоны полоски опустите на 2-3 секунды в исследуемую мочу и сразу же выньте.

5. Для удаления избытка влаги с диагностических зон полоски проведите ее длинным краем по краю контейнера (или иной емкости, в которой доставлена моча) или приложите этот край полоски к фильтровальной бумаге.

Смывать с диагностических зон полоски лишнюю мочу нельзя.

6. По истечении времени, указанного на этикетке пенала или в инструкции к каждому тесту, сравните цвет соответствующей диагностической зоны с цветной шкалой на этикетке пенала с полосками (эталоном). Порядок проведения теста представлен рисунками 1-7.

7. Реакцию оценивают как положительную или отрицательную. Или выражают в цифровом обозначении в г/л. (см. рисунок №8).

Рис. №8 Оценка результатов исследования

III Модуль. Контрольные вопросы и задания

Ответьте на поставленные вопросы, используя рабочую тетрадь

Расскажите метод определения белка в моче 50% азотной кислотой.

Расскажите метод определения белка в моче 20 % ССК.

Расскажите методику определения белка в моче методом Робетса – Стольникова – Бранберга.

Расскажите методику определения белка в моче диагностическими тест- полосками.

Какие существуют правила работы с диагностическими тест-полосками.

Назовите основные критерии правильно проведенного теста.

Расскажите методику обнаружения в моче белка Бенс-Джонса.

Диагностическое значение определения химических свойств мочи.

Клиническая оценка химических свойств мочи.

Запишите в рабочей тетради термины и дайте им обозначение , используя изученный материал

Знать теоретический и практический материал.

Отвечать на контрольные вопросы.

Литература для самостоятельной подготовки: И.И.Миронова, Л.А.Романова, В.В.Долгов. Общеклинические исследования: моча, кал, ликвор, эякулят.- М.-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2005

Источник

Как приготовить раствор ларионова