Как приготовить раствор полисорбата

Полисорб МП

Инструкция

Торговое название

Международное непатентованное название

Лекарственная форма

Порошок для приготовления суспензии для приема внутрь

Состав

Один грамм препарата содержит

активное вещество — кремния диоксид коллоидный 1,0 г

Описание

Легкий белый или белый с голубоватым оттенком порошок без запаха и вкуса. При взбалтывании с водой образует взвесь.

Фармакотерапевтическая группа

Противодиарейные препараты. Кишечные адсорбенты. Прочие кишечные адсорбенты.

Код АТХ А07ВС

Фармакологические свойства

Полисорб МП (медицинский пероральный) — неорганический, неселектив-ный, полифункциональный энтеросорбент на основе высокодисперсного кремнезема с размерами частиц до 0,09 мм, с химической формулой SiO2.

Фармакокинетика

Полисорб МП не расщепляется и не всасывается в желудочно-кишечном тракте и выделяется в неизмененном виде.

Фармакодинамика

Полисорб МП обладает сорбционными и детоксикационными свойствами. В просвете желудочно-кишечного тракта препарат связывает и выводит из организма эндогенные и экзогенные токсические вещества различной природы, включая патогенные бактерии и бактериальные токсины, антигены, пищевые аллергены, лекарственные вещества и яды, соли тяжелых металлов, радионуклиды, алкоголь. Полисорб МП сорбирует также некоторые продукты обмена веществ организма, в том числе избыток билирубина, мочевины, холестерина и липидных комплексов, а также метаболиты, ответственные за развитие эндогенного токсикоза.

Показания к применению

В лечебных целях:

— острые и хронические интоксикации различного происхождения, ост-рые отравления сильнодействующими и ядовитыми веществами, в том числе лекарственными препаратами и алкоголем, алкалоидами, солями тяжелых металлов

— острые кишечные инфекции любого генеза, включая пищевые токсико-инфекции, а также диарейный синдром неинфекционного происхождения, дисбактериоз (в составе комплексной терапии)

— гнойно-септические заболевания, сопровождающиеся выраженной интоксикацией

— пищевая и лекарственная аллергия

— гипербилирубинемия (вирусный гепатит и другие желтухи) и гипер-азотемия (хроническая почечная недостаточность).

В целях профилактики:

— жителям экологически неблагоприятных регионов и работникам вредных производств

Способ применения и дозы

Взрослым и детям внутрь только в виде водной суспензии!

Для получения суспензии необходимое количество препарата тщательно размешивают в 1/4 — 1/2 стакана воды. Рекомендуется готовить свежую суспензию перед каждым приемом препарата и выпивать ее за 1 час до еды или приема других лекарств. Перед употреблением суспензию следует взболтать!

Взрослым. Средняя суточная доза у взрослых 0,1-0,2 г/кг массы тела (6-12г). Препарат принимается в 3-4 приема в течение суток.

Максимальная суточная доза у взрослых 0,33 г/кг массы тела (20 г).

Детям. Доза для детей рассчитывается в зависимости от массы тела (см. таблицу).

Таблица подсчета суточной дозы для детей

Масса тела пациента в кг

Суточная доза в г

В случаях пищевой аллергии препарат принимается непосредственно перед приемом пищи, суточную дозу Полисорб МП разделяют в течение дня на три приема.

Длительность лечения зависит от диагноза и тяжести заболевания, курс лече-ния при острых интоксикациях 3-5 дней, при аллергических заболеваниях, хронических интоксикациях продолжительность лечения до 10-14 дней. Повторные курсы спустя 2-3 недели, по рекомендации врача.

Особенности применения Полисорб МП при различных заболеваниях.

Пищевая токсикоинфекция и острые отравления. Начинать терапию

рекомендуется с промывания желудка 0,5-1% взвесью. При тяжелых отравлениях в первые сутки промывание желудка проводят через зонд каждые 4-6 часов. Разовая доза у взрослых может составлять 0,1-0,15 г/кг массы тела больного по 2-3 раза в день.

Острые кишечные инфекции. Рекомендуется начать лечение

в первые часы или сутки заболевания в комплексе с другими способами лечения. В первые сутки — суточная доза принимается в течение 5-ти часов с интервалами между приемами в 1 час. Во 2-е сутки — суточная доза дается в 4 приема в течение суток, с интервалом 6 часов. Продолжительность лечения 3-5 дней.

Лечение вирусного гепатита. В комплексной терапии вирусного гепатита Полисорб МП применяют как детоксицирующее средство в обычных дозах в течение первых 7-10 дней болезни.

Аллергические заболевания. При острых аллергических реакциях лекарственного или пищевого генеза рекомендуется предварительное промывание желудка и кишечника 0,5-1% взвесью. Затем препарат дают в обычных дозах до наступления клинического эффекта. При хронических пищевых аллергиях рекомендуются курсы по 7-10-15 дней, препарат принимают непосредственно перед едой. Аналогичные курсы показаны при острой рецидивирующей крапивнице и отеке Квинке, эозинофилии и накануне на фоне обострения поллинозов и других атопий.

Хроническая почечная недостаточность. Используют курсы лечения в суточной дозе 0,15-0,2 г/кг массы тела в течение 25-30 дней с перерывом 2-3 недели.

С целью профилактики.

Взрослым. Средняя суточная доза у взрослых 0,1-0,2 г/кг массы тела (6-12г).

Детям. Средняя суточная доза для детей рассчитывается в зависимости от массы тела (см.выше таблицу)

Препарат принимается в 3-4 приема в течение суток

Курс приема 7-10 дней

Побочные действия

— аллергические реакции, диспепсия, запор.

При длительном, более 14 дней, приеме возможно нарушение всасывания витаминов, кальция, в связи с чем рекомендуется профилактический прием поливитаминных препаратов, кальция.

Противопоказания

язвенная болезнь желудка и 12-ти перстной кишки в фазе обострения

кровотечения из желудочно–кишечного тракта

индивидуальная непереносимость препарата

вес ребенка до 10 кг

Лекарственные взаимодействия

Возможно снижение лечебного эффекта одновременно принимаемых внутрь лекарств.

Особые указания

Одна чайная ложка Полисорб МП «с верхом» содержит 1 г препарата, одна столовая «с верхом» 2,5-3 г.

Беременность и период лактации

Применение при беременности и в период лактации считается безопасным.

Особенности влияния лекарственного средства на способность управлять транспортным средством или другими потенциально опасными механизмами

На способность управлять транспортным средством или другими потенциально опасными механизмами не влияет.

Передозировка

Случаи передозировки не отмечены.

Форма выпуска и упаковка

Порошок для приготовления суспензии для приёма внутрь.

По 1 г или 3 г помещают в пакеты одноразового использования из бумаги упаковочной или других материалов, разрешенных к применению, с термослоем.

По 10 одноразовых пакетов вместе с инструкцией по медицинскому применению на государственном и русском языках упаковывают в пачку из картона.

По 5 или 10 одноразовых пакетов с равным количеством инструкций по медицинскому применению на государственном и русском языках группируют в пакеты из полиэтилена и укладывают в гофрокороб. Допускается помещать одноразовые пакеты непосредственно в групповую упаковку, инструкции вкладываются согласно количеству пакетов.

По 12 г, 25 г и 50 г в банки из полимерных материалов или из полиэтилен-терефталата или из других материалов, разрешенных к применению, укупоренные крышками из аналогичных материалов с контролем первого вскрытия. На банку наклеивают этикетку из бумаги этикеточной или писчей или других материалов, разрешенных к применению.

По 5 или 10 банок вместе с равным количеством инструкций по меди-цинскому применению на государственном и русском языках упаковывают в термоусадочную пленку.

Условия хранения

Хранить в сухом месте, при температуре не выше 25°С.

После вскрытия упаковки хранить в плотно закрывающейся емкости.

Хранить в недоступном для детей месте!

Срок хранения

Условия отпуска из аптек

Производитель

АО «Полисорб», Россия, 456652, г.Челябинская область, г.Копейск,

ул. Томская, д.14, тел. (351) 278-19-89, тел/факс (351)778-51-26

Владелец регистрационного удостоверения

АО «Полисорб», Российская Федерация

Адрес организации принимающей претензии от потребителя по качеству

препарата на территории Республики Казахстан: ИП «Нестеренко Н.А.»,

Республика Казахстан, 050000, г. Алматы, Фурманова, д. 128, офис 16,

Источник

Полисорб МП (Polisorb MP)

Владелец регистрационного удостоверения:

Лекарственные формы

рег. №: ЛП-№(000308)-(РГ-RU) от 15.07.21 — Действующее Предыдущий рег. №: Р N001140/01

	Полисорб МП
		рег. №: ЛП-№(000308)-(РГ-RU) от 15.07.21 — Действующее Предыдущий рег. №: Р N001140/01

Форма выпуска, упаковка и состав препарата Полисорб МП

Порошок для приготовления суспензии для приема внутрь легкий, белый или белый с голубоватым оттенком, без запаха; при взбалтывании с водой образует суспензию.

1 г
кремния диоксид коллоидный	1 г

12 г — банки (1) с контролем первого вскрытия — пачки картонные.
15 г — банки (1) с контролем первого вскрытия — пачки картонные.
20 г — банки (1) с контролем первого вскрытия — пачки картонные.
25 г — банки (1) с контролем первого вскрытия — пачки картонные.
30 г — банки (1) с контролем первого вскрытия — пачки картонные.
35 г — банки (1) с контролем первого вскрытия — пачки картонные.
40 г — банки (1) с контролем первого вскрытия — пачки картонные.
45 г — банки (1) с контролем первого вскрытия — пачки картонные.
50 г — банки (1) с контролем первого вскрытия — пачки картонные.

Порошок для приготовления суспензии для приема внутрь легкий, белый или белый с голубоватым оттенком, без запаха; при взбалтывании с водой образует суспензию.

1 г
кремния диоксид коллоидный	1 г

1 г — пакеты одноразового использования (1, 2, 3, 4, 5, 10, 30, 50 или 100 шт.) — пачки картонные.
2 г — пакеты одноразового использования (1, 2, 3, 4, 5, 10, 30, 50 или 100 шт.) — пачки картонные.
3 г — пакеты одноразового использования (1, 2, 3, 4, 5, 10, 30, 50 или 100 шт.) — пачки картонные.
6 г — пакеты одноразового использования (1, 2, 3, 4, 5, 10, 30, 50 или 100 шт.) — пачки картонные.
10 г — пакеты одноразового использования (1, 2, 3, 4, 5, 10, 30, 50 или 100 шт.) — пачки картонные.
12 г — пакеты одноразового использования (1, 2, 3, 4, 5, 10, 30, 50 или 100 шт.) — пачки картонные.
50 г — пакеты двойные из полиэтилена (1) — пачки картонные.

Фармакологическое действие

Фармакокинетика

Показания активных веществ препарата Полисорб МП

Открыть список кодов МКБ-10

Код МКБ-10	Показание
A04.9	Бактериальная кишечная инфекция неуточненная
A05.9	Бактериальное пищевое отравление неуточненное
A09	Другой гастроэнтерит и колит инфекционного и неуточненного происхождения
A40	Стрептококковый сепсис
A41	Другой сепсис
B15	Острый гепатит А
B16	Острый гепатит В
B17.1	Острый гепатит С
B18.0	Хронический вирусный гепатит В с дельта-агентом
B18.1	Хронический вирусный гепатит B без дельта-агента
B18.2	Хронический вирусный гепатит С
K59.1	Функциональная диарея
K63.8	Другие уточненные болезни кишечника
L27.2	Дерматит, вызванный съеденной пищей
N18	Хроническая болезнь почек
R17	Гипербилирубинемия, с желтухой или без нее, не классифицированная в других рубриках
T50.9	Другими и неуточненными лекарственными средствами, медикаментами и биологическими веществами
T51	Токсическое действие алкоголя
T56	Токсическое действие металлов
T65.9	Неуточненного вещества
T78.4	Аллергия неуточненная
T88.7	Патологическая реакция на лекарственное средство или медикаменты неуточненная
Z57	Воздействие производственных факторов риска
Z58	Проблемы, связанные с физическими факторами окружающей среды

Режим дозирования

Для приема внутрь.

Доза и схема применения устанавливаются индивидуально, в зависимости от показаний, возраста и массы тела пациента.

Побочное действие

Противопоказания к применению

Применение при беременности и кормлении грудью

Применение при беременности и в период грудного вскармливания не противопоказано.

Применение при нарушениях функции печени

Разрешено применение при нарушении функции печени.

Применение при нарушениях функции почек

Разрешено применение при нарушении функции почек.

Применение у детей

Возможно применение по показаниям.

Особые указания

При длительном приеме (более 14 дней) возможно нарушение всасывания витаминов и кальция, в связи с чем рекомендуется профилактический прием поливитаминных препаратов и препаратов, содержащих кальций.

Источник

Способ измерения количества полисорбата-80 с применением щелочного гидролиза образца с последующей вэжх

Владельцы патента RU 2670965:

Изобретение относится к способам количественного определения полисорбата-80 в растворах терапевтических белков и к способам быстрой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Способ определения концентрации полисорбата-80 в образце, содержащем белок или гликопротеин, включающий проведение щелочного гидролиза проб, отличается тем, что после проведения щелочного гидролиза проводят анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме в течение 13-30 минут, при скорости потока фазы 0,02-5,0 мл/мин, с объемным соотношением компонентов водно-ацетонитрильной подвижной фазы в диапазоне от 30/70 до 15/95, длина колонки составляет от 30 до 300 мм, размер пор сорбента составляет от 1,7 до 5,0 мкм, детектирование аналита ведется в УФ-области спектра в диапазоне длин волн 190-220 нм, и идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика. 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл., 4 пр.

Изобретение относится к способам количественного определения полисорбата-80 в растворах терапевтических белков и к способам быстрой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предложенный способ позволяет значительно сократить время проведения анализа и повысить его чувствительность за счет применения изократической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Полисорбат-80 — один из самых популярных детергентов, предотвращающий агрегацию белка и обладающий выраженной противовирусной активностью. По этой причине его часто добавляют в полупродукты и готовые формы препаратов на основе терапевтических белков. Содержание полисорбата-80 в составе лекарственного средства должно тщательно контролироваться в связи с его склонностью к деградации.

Из уровня техники известны следующие способы решения задачи контроля содержания полисорбата-80 в продуктах: документы WO 2012119724, CN 103403544 и ЕР 2681553 раскрывают способы, включающие проведение щелочного гидролиза проб, дериватизацию продуктов гидролиза полисорбата-80 путем присоединения хромофорных меток, и последующего количественного определения полисорбата-80 оптическими способами (например, спектрофотометрией). Недостатком данного подхода можно считать необходимость предварительного осаждения белковой фракции, длительность и сложность пробоподготовки, а также высокую погрешность метода. Документ CN 101943684 раскрывает количественный анализ полисорбата-80 без гидролиза и дериватизации путем обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-детектированием сигнала. Недостатками метода являются низкие специфичность и чувствительность, а также относительно большая длительность хроматографии. Если принять во внимание необходимость проведения щелочного гидролиза образца, наиболее близким к предлагаемому способу может быть назван способ, раскрытый в документе WO 2012119724. От известного способа предложенный в настоящей заявке метод отличается тем, что после проведения щелочного гидролиза проводят анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме, детекция аналита ведется с помощью УФ-детектора, и идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика.

В целом, известные подходы, основанные на хроматографическом анализе интактного полисорбата-80, характеризуются недостатками, связанными с необходимостью предварительного осаждения белковой фракции, а также необходимостью использования дополнительных детекторов: испарительного светорассеяния, заряженного аэрозоля; невысокой чувствительностью, нелинейной зависимостью между количеством введенного вещества и откликом детектора. Недостатки подходов, связанных с предварительным проведением щелочного гидролиза полисорбата-80 с последующим присоединением хромофорной метки и

спектрофотометрическим анализом, заключаются в необходимости проведения стадий предварительного осаждения белковой фракции и присоединения метки, что отрицательно сказывается на длительности пробоподготовки и всего анализа.

Основными проблемами в количественном анализе полисорбата-80 является его полимерная природа и отсутствие хромофорных групп, что, во-первых, требует большой длительности применяемых методик хроматографического анализа как для самого полисорбата-80, так и для его характеристических производных, а во-вторых, ведет к высокому уровню ошибок при определении концентрации полисорбата-80 спектрофотометрическим методом.

Для решения проблем количественного анализа полисорбата-80 автор изобретения взял за основу способ щелочного гидролиза, совместив его с высокоэффективной жидкостной хроматографией, во время которой проводится определение количества аналита с помощью УФ-детектора. Тем самым удалось избавиться от стадий осаждения белковой фракции и дериватизации гидролизата. Применение изократического элюирования и короткой колонки позволило сократить время хроматографического анализа, повысить его чувствительность, снизить требования к хроматографической системе и расход подвижной фазы. Применение УФ-детектора в предложенном способе дает значительные преимущества в чувствительности и производительности по сравнению с применением метода ВЭЖХ в сочетании с ELS-детектором: ориентировочный предел детектирования в случае ELS-детектора составляет порядка 1.2 мкг полисорбата-80 против 25 нг в предложенном способе; общая длительность пробоподготовки составляет порядка 1,5 часов против 6 часов для ELS-детектора, а время получения одной хроматограммы составляет 5 минут (против диапазона от 13 до 30 минут, в зависимости от колонки, для ELS). Нелинейное изменение отклика ELS-детектора на ввод разных количеств полисорбата-80 усложняет построение калибровочной кривой и сужает аналитический диапазон метода. Требуется также большее количество образца для анализа: порядка 1 мл (против 0,2 мл у предложенного способа).

Снижение нижнего предела детектирования (LOD) и нижнего предела количественного обнаружения (LLOQ) было достигнуто, прежде всего, за счет минимального дрейфа базовой линии при изократическом режиме хроматографии. Высокая скорость потока и использование колонки с небольшим размером пор сорбента (в диапазоне от 1,7 до 5,0 мкм) позволяет получить узкую хроматографическую фракцию целевого компонента, а, следовательно, увеличить высоту пика, что также снижает пределы LOD и LLOQ. Установка длины волны УФ-детектора для снятия сигнала на уровне 200 нм определяет максимальное соотношение «сигнал : шум» в диапазоне от 190 до 210 нм, таким образом также улучшая параметры LOD и LLOQ.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Построение калибровочной линии на растворе стандартного образца полисорбата-80, конценрация 1 мг/мл.

Фиг. 2. Определение концентрации полисорбата-80 в испытуемых образцах.

Фиг. 3. Хроматографические профили 6 повторных инжекций Экулизумаба серии Р0002701 в разведении 1/10. Отмечены пики олеиновой кислоты.

Фиг. 4. Хроматографические профили 6 повторных инжекций Адалимумаба серии 011115 в разведении 1/100. Отмечены пики олеиновой кислоты.

Фиг. 5. Хроматографические профили первых инжекций модельных образцов полисорбата-80 в концентрации 0,025 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,75 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,25 мг/мл, 1,5 мг/мл. Отмечены пики олеиновой кислоты.

Материалы и методы.

Гидролиз полисорбата-80 проводят добавлением к 0,2 мл образца 0,2 мл 5М раствора КОН с последующей инкубацией в течение 30 минут при 85°C с получением характеристического продукта — олеиновой кислоты. По окончании инкубации к образцу дополнительно добавляют 0,1 мл 5М раствора KOH и 0,4 мл ацетонитрила. Смесь тщательно перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 минут на скорости 9300g. Затем отбирают 0,1 мл жидкости из верхнего слоя, добавляют к 0,0235 мл воды и перемешивают. Экстракт используют свежеприготовленным.

Хроматографический анализ проб

Анализ проводят с использованием хроматографической колонки с сорбентом на основе бутилсилана, пентилсилана, октилсилана или октодецилсилана, оптимально — октодецилсилана; размером пор от 1,7 до 5,0 мкм, предпочтительно от 1,7 до 3,5 мкм, оптимально — 1,8 мкм; внутренним диаметром 0,5-5,0 мм, предпочтительно — 1,0-3,0 мм, оптимально — 2,1 мм; длиной 30-300 мм, предпочтительно 30-75 мм, оптимально — 50 мм; с использованием водно-ацетонитрильной подвижной фазы с объемным соотношением компонентов в диапазоне от 30/70 до 15/95, соответственно, предпочтительно — 25/74-20/80, оптимально — 19/81; с добавкой объемной доли ион-парного реагента (дифторуксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты; предпочтительно — дифторуксусной или трифторуксусной кислоты, оптимально — трифторуксусной кислоты) в диапазоне 0,01-2%, предпочтительно — 0,05-0,5%, оптимально — 0,1% при скорости потока фазы 0,02-5,0 мл/мин; предпочтительно — 0,2-1,0 мл/мин, оптимально — 0,5 мл/мин; температуре термостата колонок от +15 до +50°C, предпочтительно — от +25 до +35°C, оптимально — при +30°C; временем регистрации хроматограммы от 1,0 до 20 минут, предпочтительно — 3,0-10,0 минут, оптимально — 5,0 минут на детекторе УФ/видимой области или диодной матрице в диапазоне длин волн 190-240 нм, предпочтительно — 195-205 нм, оптимально — 200 нм.

Идентификация целевого компонента (олеиновой кислоты).

Идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика и последующим сравнением его с временами удерживания хроматографических пиков в испытуемых образцах. Установление концентрации полисорбата-80 в исследуемом образце производят по методу внешней калибровки. Для этого вводят в хроматограф различные количества гидролизата полисорбата-80 того же производителя, что и в исследуемом образце, и строят линейную зависимость площади пика олеиновой кислоты от количества введенного гидролизата. Затем вводят значение площади пика олеиновой кислоты хроматограммы анализируемого образца в полученное уравнение зависимости и получают массовую концентрацию полисорбата-80 в пробе.

По результатам валидации методики была установлена следующая характеристика способа:

Нижний предел детектирования составляет 25 нг полисорбата-80 (125 ppb); нижний предел количественного определения — 100 нг полисорбата-80 (500 ppb).

Аналитический диапазон методики находится в границах 0,025-1,5 мг/мл полисорбата-80.

Степень извлечения находится в диапазоне 92,1-107,5%.

Максимальное значение коэффициента вариации (CV) 18 повторных определений, выполненных в течение 3 дней двумя различными операторами, характеризующего воспроизводимость методики, составляет 2,69%.

Пример 1. Количественное определение полисорбата-80 в образцах с различным содержанием модифицированного антигемофильного глобулина.

Оборудование: Система ВЭЖХ Alliance е2695, с детектором UV/Visible Detector 2489

Колонка: Zorbax Extend-C18 RRHT 2.1×50 mm 1.8 micron №USHBD05592

Параметры: Vкол=0.17 мл, Рmax=8700 psi; рН=2.0-11.5

Условия: Скорость потока: 0,5 мл/мин

Время и параметры регистрации хроматограммы: 5 мин

температура колонки = 30°C; температура образца = 25°C; □=200 нм

Подвижная фаза: 0,1% ТФУ в 81% ацетонитриле

Реагенты: 5М раствор KOH, исходный раствор полисорбата-80 с концентрацией 200,0 мг/мл, стандартный раствор полисорбата-80 с концентрацией 1,0 мг/мл.

Приготовление подвижной фазы: Смешать 202.5 мл ацетонитрила, 250 мкл трифторуксусной кислоты и довести до 250 мл водой очищенной.

Раствор олеиновой кислоты с концентрацией 1 мг/мл: 0,1 г олеиновой кислоты растворить в 90 мл смеси ацетонитрил : вода в соотношении 1:1, довести объем раствора до 100 мл смесью ацетонитрил : вода в соотношении 1:1

Испытуемый раствор / Стандартный раствор полисорбата-80. 0,2 мл испытуемого образца / стандартного раствора полисорбата-80 с концентрацией 1,0 мг/мл поместить в центрифужную микропробирку вместимостью 1,5 мл, добавить 0,2 мл 5 М раствора гидроксида калия, перемешать и инкубировать в течение 30±2 мин в термошейкере при температуре (85±0,2)°C.

По окончании инкубации к полученному раствору добавить 100 мкл 5 М раствора гидроксида калия, 400 мкл ацетонитрила, тщательно (в течение 20 секунд) перемешать на Вортекс V-1 plus и центрифугировать полученный раствор в течение 5 мин со скоростью 9300 g при температуре (22±0,1)°C. Далее, из приготовленных растворов перенести 100 мкл жидкости из верхнего слоя в пробирку вместимостью 1,5 мл, добавить 23,5 мкл воды и перемешать. Полученные таким образом холостой раствор / испытуемый раствор / Калибровочный раствор полисорбата-80 перенести в соответствующим образом промаркированные флаконы.

Процесс построения калибровочной линии проиллюстрирован на Фиг. 1. Определение концентрации полисорбата-80 в опытных образцах проиллюстрировано на Фиг. 2.

Пример 2. Определение предела количественного определения пика олеиновой кислоты

Анализировались разведения 1 серии лекарственного препарата (далее ЛП) Экулизумаб и 1 серии ЛП Адалимумаб по 6 инжекций каждого, начиная от 2 мкг/мл до рабочей концентрации ЛП.

— Соотношение уровня сигнала к уровню шума для пика олеиновой кислоты должно быть ≥10:1 по крайней мере 5 раз из 6 повторов.

— RSD шести определений для ЛП Экулизумаб должно быть меньше или равно 7,5%, для ЛП Адалимумаб — меньше или равно 10,7%.

Предел количественного определения пика олеиновой кислоты был определен как концентрации белков в ЛП Экулизумаб — 20 мкг/мл, что составляет 10% от рабочей концентрации, и в ЛП Адалимумаб — 10 мкг/мл, что составляет 1% от рабочей концентрации. Эти концентрации дают сигнал приблизительно в 10 раза больше, чем уровень шума.

Пример 3. Проверка линейности аналитического диапазона

Анализировались модельные образцы полисорбата-80 по 6 инжекций каждого, начиная от 0,025 до 1,5 мг/мл. По итогам эксперимента строили график зависимости заданной концентрации полисорбата-80 в модельных образцах от площади пика олеиновой кислоты и аппроксимировали его линейной функцией.

Коэффициент детерминации (R 2 ) линейной зависимости концентрации полисорбата-80 от площади пика олеиновой кислоты должен составлять ≥0,98 (что соответствует значениям модуля коэффициента корреляции r≥0,99).

Результаты представлены на Фиг. 5.

Полученное уравнение линейной функции: у=992428х-10538,

Коэффициент детерминации: 0.9998.

Зависимость заданной концентрации полисорбата-80 в модельных образцах от полученной площади пика олеиновой кислоты линейна, результаты соответствуют критериям оценки.

Пример 4. Проверка правильности метода.

Анализировались модельные образцы полисорбата-80 в диапазоне концентраций от 0,025 мг/мл до 1,5 мг/мл по 6 инжекций каждого. По полученным результатам рассчитывали коэффициент вариации (%R)

Анализировались модельные образцы полисорбата-80 по 6 инжекций каждого, начиная от 0,025 до 1,5 мг/мл. По калибровочной кривой, построенной с помощью стоковых растворов полисорбата-80 (0,2 мг/мл и 1,0 мг/мл) рассчитывали концентрацию полисорбата-80 в модельных образцах. По итогам определяли коэффициент вариации. Результаты представлены на Фиг. 5 и Таблице 6.

Для расчета концентрации полисорбата-80 в образце использовались калибровочные кривые, построенные с использованием стоковых растворов полисорбата-80 (0,2 и 1,0 мг/мл).

Степень извлечения, характеризующую способ, вычисляли по формуле

где R (Recovery) — выход, А — измеренное содержание, В — заданный (фактический) уровень.

1. Способ определения концентрации полисорбата-80 в образце, содержащем белок или гликопротеин, включающий проведение щелочного гидролиза проб, отличающийся тем, что после проведения щелочного гидролиза проводят анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме в течение 13-30 минут, при скорости потока фазы 0,02-5,0 мл/мин, с объемным соотношением компонентов водно-ацетонитрильной подвижной фазы в диапазоне от 30/70 до 15/95, длина колонки составляет от 30 до 300 мм, размер пор сорбента составляет от 1,7 до 5,0 мкм, детектирование аналита ведется в УФ-области спектра в диапазоне длин волн 190-220 нм, и идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика.

2. Способ по п. 1, где используемый сорбент выбран из бутилсилана, пентилсилана, октилсилана или октодецилсилана, предпочтительно октодецилсилана.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, где размер пор сорбента составляет предпочтительно от 1,7 до 3,5 мкм, оптимально 1,8 мкм.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где внутренний диаметр колонки составляет от 0,5 до 5,0 мм, предпочтительно от 1,0 до 3,0 мм, оптимально до 2,1 мм.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где длина колонки составляет предпочтительно от 30 до 75 мм, оптимально 50 мм.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где используют водно-ацетонитрильную подвижную фазу с объемным соотношением компонентов предпочтительно в диапазоне от 25/74 до 20/80, оптимально 19/81.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где к подвижной фазе добавляют ион-парный реагент, выбранный из дифторуксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты в объемной доле 0,01-2%, предпочтительно 0,05-0,5%, оптимально 0,1%.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где хроматография ведется при скорости потока фазы предпочтительно 0,2-1,0 мл/мин, оптимально 0,5 мл/мин.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где температура термостата колонок составляет от +15 до +50°С, предпочтительно от +25 до +35°С, оптимально при +30°С.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где время регистрации хроматограммы составляет от 1 до 20 минут, предпочтительно от 3 до 10 минут, оптимально 5 минут.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где детектирование проводят на детекторе УФ видимой области или диодной матрице предпочтительно в диапазоне волн 195-205 нм, оптимально 200 нм.

Источник