Как приготовить среды гиса

Как приготовить среды гиса

Углеводные среды применяют для дифференциации бактерий по способности ферментировать углеводные субстраты.

При ферментации углеводов образуется смесь кислот (молочной, уксусной и др.), которые снижают значение pH. Конечные продукты ферментации углеводов и спиртов в большинстве случаев газообразные вещества (водород и углекислый газ).

Для обнаружения ферментации углеводов в среды Гисса вводят индикатор (индикатор Андреде, ВР-водно-голубой и розоловую кислоту, бромтимоловый синий и др.). Для выявления газообразования в жидких средах применяют трубки Durhem — поплавки (маленькие трубочки, запаянные с одного конца). Образующийся газ вытесняет жидкость из поплавков. Пузырьки, заполненные газом, находятся у запаянного конца трубки. О процессе газообразования в полужидких средах судят по пузырькам, разрывам или трещинам, появляющимся в толще агара.

Среды различаются по составу питательных субстратов с целью обеспечения возможности их применения для определения ферментации углеводов у бактерий с различными потребностями в питательных компонентах и биологически активных добавках, представленных антибиотиками, витаминами или определенными химическими соединениями.

Рецепт 73. Цветные среды Гисса с углеводами (жидкие):
Пептон — 10,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Углевод — 5,0-10,0 г
Индикатор Андреде — 10 мл
(или 1 мл 1,6% раствора бромтимолового синего)
pH 7,2(±0,2)

К 1000 мл дистиллированной воды прибавляют 10 г пептона и 5,0 г натрия хлорида. Пептон и соль растворяют при нагревании воды в течение нескольких минут, фильтруют через бумажный фильтр, так чтобы среда была совершенно прозрачной. Устанавливают pH. Прибавляют индикатор, 10 г одного из необходимых углеводов (лактозы, глюкозы, маннита, целлобиозы или 5,0 г крахмала, декстрина, гликогена), а затем индикатор Андреде из расчета 10 мл на 1000,0 мл среды или 1 мл раствора 1,6% индикатора бромтимолового синего.

Готовую среду разливают по 3,0 мл в пробирки вместе с поплавками, расположенными запаянным концом кверху. Среду стерилизуют при 112°С в течение 20 мин. Во время стерилизации поплавки доверху заполняются питательной средой.

Готовая среда бесцветная или имеет розоватый оттенок с индикатором Андреде и травянисто-зеленый цвет — с индикатором бромтимоловым синим.

Питательной основой сред для определения ферментации углеводов является пептонная вода (см. рецепт 59). Мясной бульон для этой цели не пригоден, так как он содержит различные углеводы, что может привести к получению ложных результатов.

В результате роста бактерий, сопровождающегося расщеплением углеводов с образованием кислых продуктов распада, цвет среды изменяется: в первом случае она становится ярко-розовой, во втором — желтой. Образование газа в среде определяют по наличию пузырьков, собирающихся в поплавке.

Рецепт 74. Цветные среды Гисса с углеводами (полужидкие):
Пептон — 10,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Углевод —5,0-10,0 г
Индикатор Андреде — 10 мл
(или 1 мл 1,6% раствора бромтимолового синего)
Агар — 5,0-8,0 г
Вода дистиллированная — 1000 мл
pH 7,2(±0,2)

После растворения ингредиентов в 1000 мл дистиллированной воды среду охлаждают до 50 °С, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности. Устанавливают pH, добавляют 5-10 г одного из необходимых углеводов (лактозу, глюкозу, маннит, ксилозу, арабинозу или 5,0 г крахмала, декстрина, гликогена и др.), а затем индикатор Андреде (10 мл на 1000 мл среды) или 1 мл 1,6% бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 4 мл в узкие стерильные пробирки. Среду стерилизуют при 112 °С в течение 20 мин.

В результате роста бактерий, расщепляющих соответствующий сахар, среды, содержащие индикатор Андреде, приобретают ярко-розовую окраску, а среды с бромтимоловым синим из травянисто-зеленых превращаются в желтые.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 13.09.2019

Источник

Выделение фага из объектов окружающей среды

Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал (вода, суспензия фекалий и др.) через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате определяют качественным и количественным методами.

1. Качественный метод определения фагов

Чашку Петри спитательным агаром засевают суточной бульонной культурой бактерий газоном и подсушивают при 37°С в течение 10-15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.

2. Количественный метод — определение титра фага по методу Грациа

Для постановки опыта предварительно:

а) разливают питательный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате;

б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по 3-4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане.

Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10 -2 – 10 -7 в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага (10 -7 ) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выливают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45°С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя.

Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10 -6 ) с бактериями и полужидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем — из разведения 10 -5 . После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37°С, затем подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси.

Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в1 мл исходной суспензии фага – титр.

8. Порядок действий при приготовлении препарата «висячая капля»

Для приготовления препарата небольшую каплю суспензии микроорганизмов наносят на покровное стекло, переворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением в центре, края которого предварительно обмазаны вазелином.

Если имеют дело с культурой на жидкой среде, то маленькую капельку культуры прямо наносят на тщательно вымытое покровное стекло; если же имеется культура на плотной среде, то на покровное стекло предварительно наносят маленькую капельку водопроводной воды или физиологического раствора, затем петлей прикасаются к культуре и приставшие к ней бактерии размешивают в приготовленной капельке. Можно также заранее приготовить взвесь микроорганизмов в физиологическом растворе и взять капельку из нее.

Предметное стекло слегка прижимают к покровному, в результате чего оба стекла склеиваются. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. Под микроскопом край капли сначала отыскивают со слабым увеличением и при суженной диафрагме, а потом исследуют препарат при помощи более сильной сухой или иммерсионной системы.

9. Порядок действий при приготовлении препарата «раздавленная капля»

На обезжиренное предметное стекло прокаленной петлей наносят каплю стерильной воды, в которую той же петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры микроорганизма (дрожжей или бактерий), взятой с твердой питательной среды. Из жидкой среды культуру берут вместе с каплей жидкости, а при надобности добавляют каплю стерильной воды. Суспензия культуры микробов на стекле должна давать лишь слабую муть.

При микроскопировании дрожжей в каплю жидкости на стекле добавляют петлей небольшое количество метиленовой сини (до голубого окрашивания) и всю эту смесь тщательно размешивают. Прижизненная окраска дрожжей метиленовой синью применяется для того, чтобы выявить мертвые клетки, легко окрашивающиеся в синий цвет. Живые клетки остаются неокрашенными, так как не пропускают краску через свою оболочку. Приготовленный на предметном стекле препарат дрожжей накрывают покровным стеклом и рассматривают с объективом 40Х.

Препарат живых бактерий готовится подобно препарату дрожжей, но бактерии рассматривают без добавления краски. На поверхность покровного стекла наносится капля иммерсионного масла, и препарат рассматривается с иммерсионным объективом 90X, лучше всего в затемненном поле (т.е. с прикрытой диафрагмой). Если культура бактерий подвижная, то хорошо видны быстрые разнохарактерные движения отдельных клеток.

При приготовлении препаратов в раздавленной капле нужно помнить следующее:

1. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться его ребром к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить стекло.

2. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не переливалась за края и не попадала на верхнюю сторону покровного стекла. Избыток воды снимают кусочком фильтровальной бумаги.

3. Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под покровным стеклом, обычно не мешают наблюдению. Но если пузырьков много, препарат следует приготовить заново.

4. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микроорганизмы не заслоняли друг друга.

5. Приготовленные препараты рассматривают немедленно (особенно живых бактерий), так как в противном случае вода высыхает и клетки бактерий теряют подвижность.

6. Бактериологическую петлю (или иглу) перед каждым очередным пассажем и после него (нанесение капли воды на стекло, снятие культуры с агара и ее размешивание, взятие краски и т.д.) следует обязательно докрасна прокаливать в пламени горелки.

После прокаливания петлю быстро охлаждают на воздухе (держат 2-3 сек, ни к чему не прикасаясь).

10. Классификация микроорганизмов по отношению к окраске по Граму

Окраска по Граму позволяет дифференцировать микроорганизмы на грамотрицательные (Грам«-») и грамположительные (Грам«+»).

Отношение бактерий к данной окраске определяется способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом.

· в клеточной стенке муреиновый слой, содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту;

· на поверхности клетки комплекс протеин – рибонуклеат магния;

· соотношение в цитоплазме РНК к ДНК 8:1;

· изоэлектрическая точка цитоплазмы = 2,0-3,0;

· проницаемость клеточной стенки ниже;

– создание оптимальных условий для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.

Окрашивание в сине-фиолетовый цвет.

· соотношение в цитоплазме РНК к ДНК 1:1;

· изоэлектрическая точка цитоплазмы = 2,0-3,0;

· проницаемость клеточной стенки выше;

Окрашивание в красный цвет.

11. Перечислить виды микроорганизмов, окраску которых необходимо производить по способу Циля-Нильсена и почему?

См. Борисов Л.Б. – Руководство к лабораторным занятиям по МБ (стр. 26)

12. Характеристика культуральных свойств микроорганизмов, выросших на среде Эндо, указать последовательность дальнейшего исследования

См. Борисов Л.Б. – Руководство к лабораторным занятиям по МБ (стр. 46)

13. Характеристика культуральных свойств микроорганизмов, выросших на среде Плоскирева, и указать последовательность дальнейшего исследования

См. Борисов Л.Б. – Руководство к лабораторным занятиям по МБ (стр. 46)

14. Характеристика культуральных свойств микроорганизмов, выросших на среде Левина и указать последовательность дальнейшего исследования

См. Борисов Л.Б. – Руководство к лабораторным занятиям по МБ (стр. 46)

15. Характеристика культуральных свойств микроорганизмов, выросших на молочно­солевом агаре, принципы элективности среды и указать последовательность дальнейшего ис­следования

Среда используется для определения в молочных продуктах, богатых белком нормируется содержания коагулазоположительного S. aureus – возбудителя пищевой интоксикации. Колонии S. aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2-4 мм, слегка выпуклых.

Приготовление среды:

В 100 мл МПБ растворяют 6,5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121°С 20 мин. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45°С, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри.

После посева чашки выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 ч.

16. Оценить результаты исследования ферментативной активности бактерий на среде Олькеницкого и указать последовательность дальнейшего исследования

Среда Олькеницкого готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1%), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор.

Среду после стерилизации в расплавленном виде оставляют застывать в таком виде, что бы получился столбик и скошенная часть. Посев производят штрихом по скошенной части и уколом в столбик.

При сбраживании углеводов, которые содержатся в большом количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров) изменяется цвет всей среды; при сбраживании глюкозы изменяется только цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков газа в столбике агара.

Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий расщеплять белки с образованием сероводорода, что определяется по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чёрного цвета.

Если произошло выделение H₂S, произошел разрыв в толще агара, произошло почернение, то мы можем судить о наличии сальмонелл, и далее производим реакцию агглютинации.

17. Идентифицировать культуру микроорганизмов по результатам определения биохими­ческой активности на средах Гиса

Гиса среды («пестрый ряд») – дифференциально-диагностические питательные среды, используемые для выявления сахаролитической активности бактерий (кишечной группы).

Содержат 1% пептонную воду, 0,5% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). рН среды = 7,2-7,4. Среда бесцветна, при ферментации углеводов приобретает красный цвет.

Среды Гиса бывают жидкими и полужидкими. В пробирки с жидкими средами для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают «поплавок» — трубочку диаметром 0,5-0,7 см, запаянную с одного конца. «Поплавок» помещают запаянным концом кверху. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в «поплавке», вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек.

В полужидких средах Гиса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стойкой пены на ее поверхности. Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, со­держащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуе­мой микробной культуры.

18. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом стандартных дис­ков и оценка результатов

Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в чашке Петри. На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинако­вом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при температуре 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чув­ствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо приме­нять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов.

19. Описать принципы определения состава и количества микроорганизмов – представи­телей нормальной микрофлоры человека

Мутуализм (взаимно полезное сожительство) и комменсализм (сожительство, односторонне полезное для одного из симбионтов, не причиняющее вреда другому) – две формы симбиоза, характерные для нормальной микрофлоры организма здорового человека. Для микроскопического исследования берут мазки из зева, мазки из зубного налета, мазки ватным тампоном, смоченным в физ. растворе, с запястья ладоней.

На поверхности кожи различают собственную микрофлору и транзиторную, микробы которой быстро погибают под влиянием бактерицидных свойств кожи (действие выделений потовых и сальных желез), антагонизма аутохтонных видов. Постоянная микрофлора пред­ставлена главным образом стафилококками (в первую очередь эпидермальными, а также золотистыми), коринебактериями, сарцинами. Место постоянного обитания – роговой слой кожи, протоки сальных желез, волосяные фолликулы. У некото­рых людей обнаруживаются стрептококки, дрожжеподобные гри­бы рода Candida, спорообразующие аэробные бактерии. Наиболь­шее число микроорганизмов обитает в склад­ках кожи.

Микрофлора желудка бедна. Несмотря на попадание с пищей, слюной большого количества микроорганизмов, в 1 мл желудоч­ного содержимого обнаруживается лишь несколько десятков ты­сяч особей и в основном –кислотоустойчивые (лактобактерии, дрожжи и др.). Большинство попадающих в этот биотоп микро­организмов погибают под действием соляной кислоты желудоч­ного сока.

Микрофлору тонкого кишечника принято подразделять на постоянную (защитную, сапрофитную) и оппортунистическую (условно-патогенную). Постоянная защитная микрофлора наиболее многочисленная (до 95%) и в основном представлена лактобактериями, бифидобактериями и кишечной палочкой с нормальными ферментативными свойствами. Как раз они и обеспечивают колониальную резистентность биотопа кишечника: так, бифидобактерии, лактобактерии выделяют молочную, уксусную кислоты, другие вещества, обладающие избирательным антимикробным действием, что подавляет избыточное размножение условно-патогенной микрофлоры и препятствует проникновению и закреплению на слизистой патогенных микробов.

Микрофлора толстого кишечника отличается численным превалированием анаэробов: бифидобактерий, бактероидов, лактобактерий, вейллонелл, клостридий, пептококков – 96-99%всей микрофлоры данного биотопа. Аэробы и факультативные анаэробы (1-4%) представлены энтеробактериями, стафилококками, стрептококками (главным образом фекальными), дрожжеподобными грибами рода Candi­da, кишечными амебами и др.

Наиболее богата по разнообразию видов бактерий, грибов, простейших, вирусов. Постоянные обитатели способны к адгезии – прикреплению к поверхности зубов или слизистой оболочки. Состав микрофлоры зависит от состояния организма, от состава пиши, от гигиены полости рта.

Микрофлора дыхательных путей

Микроорганизмы, содержащиеся во вдыхаемом воздухе, большей частью погибают в полости носа. Собственная же мик­рофлора носа представлена стафилококками, дифтероидами, нейссериями. У части людей на слизистой оболочке носа постоянно обнаруживаются условно-патогенные золотистые стафилококки. Это явление расценивается как резидентное носительство.

Трахея и бронхи свободны от постоянной микрофлоры. Только при нарушении активности эпителия бронхов (например, при ингаляционном наркозе, заболеваниях дыхательной системы, им­мунодефицитах) микроорганизмы могут проникнуть в глубь брон­хиального дерева.

Свободны от микрофлоры кровь и внутренние органы, не сообщающиеся с внешней средой, такие как мозг, сердце, печень, селезенка и др. В норме не имеют резидентной микробной флоры такие органы, как матка, мочевой пузырь, легкие.

20. Описать принципы определения и исследуемые характеристики фагоцитарного звена иммунологической защиты организма

Для оценки активности фагоцитов используют следующие показате­ли:

1) фагоцитарный показатель – процент фагоцитирующих клеток от общего числа учтенных нейтрофильных лейкоцитов;

2) фагоцитарное число – сред­нее число микробных клеток, поглощенных одним лейкоци­том (характеризует интенсив­ность фагоцитоза).

Определение фагоцитарного показате­ля

В чистую стерильную пробирку вносят 0,2 мл 2%-го раствора цитрата на­трия, 0,1 мл крови, взятой у морской свинки или кролика, и 0,05 мл суспензии убитых нагреванием бактерий S. epidermidis, Е. coli или др. Компоненты перемешивают и выдержива­ют при 37-38°С 30 мин, затем центрифугируют 15-20 мин до образования прозрачного слоя плазмы, слоя эритроцитов и тонкого сероватого среднего слоя лейкоцитов. Осторожно отсасывают плазму, пипеткой берут средний слой, делают три-пять мазков и окрашивают по методу Романовского—Гимзе. Препарат микроскопируют, подсчитыва­ют не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов и определяют среди них число (%) фагоцитирующих.

Источник