Как приготовить стандарт мутности по макфарланду

Стандарт мутности

При проведении различных бактериологических исследований часто возникает необходимость приготовить инокулюм, содержащий определенное количество микробных клеток (вернее сказать — колониеобразующих единиц, КОЕ). Для этого готовят серию последовательных разведений исходной суспензии. Концентрацию клеток в ней оценивают, сравнивая ее мутность с контрольным эталоном.

Первоначально эталон готовили из взвеси Salmonella typhi, инактивированных 2% формалином или прогреванием при 60 0 С в течение 1,5 часов и законсервированных добавлением 0,5% фенола. Однако, бактериальные эталоны мутности очень нестабильны при хранении и им на смену пришел стеклянный международный эталон.

Стандарт мутности (син.: международный стандарт мутности, стеклянный стандарт мутности), утвержденный Всемирной организацией здравоохранения первичный эталон мутности для оптической стандартизации бактериальных взвесей, соответствующий мутности взвеси бактерий Борде — Жангу, содержащей 10 10 клеток в 1 мл, т.е. равный 10 единицам мутности; представляет собой взвесь частиц стекла пирекс. В нашей стране такой эталон выпускает Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича. Он представляет собой взвешенные в дистиллированной воде частицы стекла «Пирекс» диаметром от 0,5 до 3,5 мкм. Взвесь этого стекла химически устойчива, не коагулирует при седиментации частиц, при взбалтывании осадка образует взвесь исходной дисперсности и мутности. Стандарт состоит из трех запаянных пробирок-эталонов, эквивалентных по степени мутности 5, 10 и 20 международным единицам мутности. Мутность стандарта на 10 единиц соответствует следующей концентрации микроорганизмов:

микробы кишечной группы	8,5 · 10 8 КОЕ/мл
микробы коклюшной группы	1,0 · 10 10 КОЕ/мл
бруцеллы	1,5 · 10 9 КОЕ/мл
холерный вибрион	2,0 · 10 9 КОЕ/мл
туляремийные микробы	4,5 · 10 9 КОЕ/мл

К комплекту бактериальных эталонов прилагаются шрифтовая таблица, содержащая набор различных шрифтов, и две пустые пробирки, диаметр, толщина стенок и цвет стекла которых точно соответствуют пробиркам-эталонам, так как при сравнении микробной взвеси одной концентрации, содержащейся в пробирках разных диаметров, мутность жидкости будет неодинаковой.

Хотя стеклянный стандарт официально является международным, наиболее широкое распространение в лабораторной практике получил стандарт McFarland на основе хлорида бария. Предложенный Джозефом Макфарландом в 1907 году, этот эталон указан практически во всех нормативных документах, включая стандарты серий DIN, ISO, EN.

Шкала McFarland охватывает диапазон от 1,0 · 10 8 КОЕ/мл до 3,0 · 10 9 КОЕ/мл (0,5 — 10 Ед). Ведущие микробиологические фирмы производят стандарты, наиболее часто применяемые в лабораториях в повседневной работе, однако, при необходимости они легко могут быть изготовлены самостоятельно.

Приготовление стандарта мутности

Для получения наиболее широко используемого стандарта McFarland 0,5 Ед смешивают 0,5 мл 1,175% (вес/объем) взвеси двухводного хлорида бария (BaCl₂·2H₂O) и 99,5 мл 1% (объем/объем) серной кислоты (H₂SO₄). Полученную взвесь разливают по 5-6 мл в пробирки, идентичные тем, в которых будет готовиться взвесь бактерий, и тщательно закрывают пробками, герметизируя их при помощи пленки типа «Parafilm» или другим способом, предупреждающим испарение жидкости. Такой стандарт мутности может храниться до 6 месяцев в темноте при комнатной температуре (22-25 0 С). На пробирки со стандартами необходимо нанести специальные метки, позволяющие контролировать постоянство объема жидкости. Перед применением стандарт мутности необходимо интенсивно встряхнуть для получения равномерной взвеси хлорида бария. Состав различных вариантов стандарта McFarland приведен в таблице

Состав стандарта мутности McFarland

McFarland Standard No.	0.5	1	2	3	4
BaCl2·2H2O 1,175%	0,5 ml	0,1 ml	0,2 ml	0,3 ml	0,4 ml
H2SO4 1%	99,5 ml	9,9 ml	9,8 ml	9,7 ml	9,6 ml
Концентрация бактерий	1,0 × 10 8	3,0 × 10 8	6,0 × 10 8	9,0 × 10 8	1,2 × 10 9
Пропускание (%)*	74.3	55.6	35.6	26.4	21.5
Поглощение*	0.132	0.257	0.451	0.582	0.669
*Длина волны 600 нм
Для точного приготовления суспензии необходимо использовать специальную карту сравнения. Она может быть приобретена вместе со стандартом или изготовлена самостоятельно.

Контроль стандарта мутности

Для быстрого контроля можно использовать спектрофотометр или нефелометр с кюветой 1 см . Определение пропускания или поглощения света позволяет достаточно точно оценить качество приготовленного эталона.

Альтернативным методом контроля является мерный посев на неселективную среду из разведений контрольного штамма (например E.coli)

Вариант № 1

1. Вырастить эталонную культуру на агаре Мюллера-Хинтона в течение 18-24 часов при температуре 37 0 С.
2. Приготовить суспензию микроорганизмов в стерильном изотоническом растворе, не допуская образования комков. Уровнять мутность суспензии и стандарта McFarland, добавляя культуру или стерильный физраствор.
3. В стерильные пробирки разлить по 4,5 мл стерильного изотонического раствора. Подписать пробирки ( от № 1 до № 7)
4. Тщательно перемешать исходную суспензию и перенести пипеткой 0,5 мл в пробирку № 7.
5. Тщательно перемешать разведение, 5-10 раз заполняя и опорожняя пипетку. Пипетка при этом все время должна быть погружена в жидкость. Не допускается продувания воздуха через жидкость.
6. Новой пипеткой перенести 0,5 мл из пробирки № 7 в пробирку № 6.
7. Повторить пп. 5 и 6 для получения необходимого количества разведений.
8. Подсушить 4 чашки с агаром Мюллера-Хинтона. Подписать чашки (от № 1 до № 4)
9. Стерильной пипеткой перенести 0,1 мл жидкости из пробирки № 1 в чашку № 1.
10. Той же пипеткой 0,1 мл разведения из пробирки № 2 перенести в чашку № 2, из пробирки № 3 – в чашку № 3, из пробирки № 4 – в чашку № 4.
11. Стерильным стеклянным или металлическим шпателем равномерно распределить жидкость в чашке № 1.
12. Тем же шпателем распределить жидкость последовательно в чашках №№ 2, 3 и 4.
13. Инкубировать чашки при 37 0 С 18 – 24 часа
14. Подсчитать количество выросших колоний

Интерпретация полученных результатов основывается на том, что стандарт мутности McFarland 0,5 эквивалентен концентрации микроорганизмов примерно 10 8 КОЕ/мл. При правильном приготовлении исходной суспензии и десятикратных разведений на чашке № 3 должно вырастать около 300 колоний. В противном случае в расчет принимается результат, полученный на чашке № 2.

Вариант № 2

1. Приготовить исходную суспензию и разведения, как указано в пп. 1-7 варианта № 1.
2. чашки с агаром Мюллера-Хинтона. Подписать чашки от № 1 до № 5
3. При помощи микродозатора на 20 мкл стерильным наконечником нанести 5 капель из пробирки № 1 на чашку № 1. Аккуратным покачиванием распределить капли по поверхности агара, не допуская их слияния.
4. Повторить п. 3. для остальных разведений.
5. После полного впитывания жидкости чашки перевернуть и инкубировать в термостате при 37 0 С 18 – 24 часа.
6. Подсчитать количество колоний в каплях.

Стандарты мутности по Мак-Фарланду используются как образцы для приготовления бактериальной суспензии.

Артикул

Название(русское/английское)

Фасовка

Описание

Cтандарты мутности по Мак-Фарланду в наборе (0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0)

Набор содержит по 1 стандарту 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 и 4.0, с картой для визуального сравнения при интерпретации;размеры пробирок 15×103 мм

Источник

Общая характеристика методов

Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диффузионные.

Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП — величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК).

МПК — минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде.

Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма, и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро — и микроразведений.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пограничным значениям (breakpoints) МПК (см. ниже). Этот принцип исследования широко используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК.

В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Однако, диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или резистентный).

Е-тест представляет собой узкую полоску полимера, (0,5 х 6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АБП в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются изготовителем к набору реактивов, в этой связи, детали метода рассматриваться не будут.

Основные этапы проведения тестирования

Оценка антибиотикочувствительности независимо от конкретного метода предполагает последовательное выполнение нескольких этапов:

• приготовление питательных сред;
• приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма);
• инокуляция;
• инкубация;
• учет и интерпретация результатов, формулировка рекомендаций по лечению.

Диффузионные методы включают также этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.

Приготовление питательных сред для определения чувствительности

Для оценки чувствительности необходимо использовать только специально предназначенные для этой цели среды, по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям приведенным в разделе 5. Внутрилабораторный контроль качества среды необходимо проводить при использовании всех известных коммерчески доступных питательных сред (Мюллера-Хинтон, Изосенситест, АГВ и др.) независимо от их производителя.

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяется выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тестируемого микроорганизма.

Выбранная питательная среда для определения чувствительности готовится из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливают в стерильные пробирки или в чашки Петри, или (если необходимо) колбы со средой помещают на водяную баню при 48 — 50 °С, где выдерживают до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят термолабильные питательные добавки и/или рабочие растворы антибиотиков, а затем разливают в пробирки или в чашки Петри.

Агар разливается по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм — 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при + 4 — + 8 °С в течение 5 суток.

Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма)

Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, ее концентрация должна составлять 1,5 x 10 8 КОЕ/мл. Практически наиболее приемлемым методом оценки концентарации бактериальной суспензии является измерение ее оптической плотности. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1,5 x 10 8 КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5 по МакФарланду. Контроль оптической плотности суспензии может также осуществляться спекторофотометрически (денситометрически). Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры. Бактериальную суспензию можно готовить либо из бульонной, либо из агаровой культуры.

Приготовление инокулюма из агаровой культуры

Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту МакФарланда. Инокулюм следует использовать в течение 15 минут после приготовления.

Приготовление инокулюма из бульонной культуры

При определении чувствительности быстро растущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5 — 6 часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0 — 5,0 мл жидкой неселективной питательной среды. Инкубируют при 35 °С. Примерно через 5 — 6 ч инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.

Стандарт МакФарланда может быть либо приобретен из коммереческих источников, либо приготовлен в лаборатории.

Источник