Как приготовить уксусную кислоту для подсчета лейкоцитов

Как приготовить уксусную кислоту для подсчета лейкоцитов

Принцип . Подсчет лейкоцитов при микроскопии в определенном числе квадратов счетной камеры и расчет их количества в 1 л крови с учетом разведения крови и объема счетной камеры.

Реактив : 3–5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный для окраски ядер лейкоцитов несколькими каплями раствора метиленового синего. Раствор имеет голубой цвет, может длительно храниться.

Ход определения . В сухую пробирку наливают 0,4 мл раствора уксусной кислоты. Из пальца набирают 0,02 мл крови (можно использовать стабилизированную антикоагулянтом венозную кровь). Вытирают кончик пипетки, затем выдувают из нее кровь на дно пробирки, перемешивают, повторно набирая и выдувая смесь крови и реактива (пипетируя). Маркируют пробирку и оставляют ее до момента подсчета. Хранить смесь крови с раствором уксусной кислоты рекомендуется не более 2–4 ч.

Кровь, разведенную в пробирке уксусной кислотой, тщательно перемешивают и заполняют ею счетную камеру. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин для оседания лейкоцитов. Не меняя горизонтального положения камеры, помещают ее на столик микроскопа и при малом увеличении (окуляр 10×, объектив 8×) подсчитывают лейкоциты в 100 больших квадратах, что соответствует 1600 малым.

Для большей точности лейкоциты считают по всей сетке в больших квадратах, не разделенных на малые квадраты и полосы, начиная с верхнего левого угла сетки. Для лучшего контрастирования затемняют поле зрения, опуская конденсор и закрывая диафрагму. Считают клетки, расположенные внутри квадрата и лежащие на любых двух линиях, чтобы дважды не подсчитывать одну и ту же клетку.

Расчет числа лейкоцитов проводят по формуле:

где X — число лейкоцитов в 1 мкл крови; а — число лейкоцитов в 100 больших квадратах; 20 — разведение крови; 100 — число больших квадратов; 250 — коэффициент пересчета на 1 мкл, так как объем одного большого квадрата равен 1/250 мкл (сторона квадрата — 1/5 мм, высота — 1/10 мм).

На практике для расчета количества лейкоцитов в 1 мкл крови их число в 100 больших квадратах умножают на 50, а в 1 л — полученную величину умножают на 106.

Примечание . При подсчете лейкоцитов неизбежна ошибка в 6–8 % случаев.

1. При большом количестве нормоцитов в периферической крови их засчитывают в число лейкоцитов (и лейкоциты, и нормоциты — ядросодержащие клетки). Для того чтобы правильно установить количество лейкоцитов, из общего числа ядросодержащих клеток крови следует вычесть количество нормоцитов.
2. Остальные ошибки аналогичны тем, которые возникают при подсчете в счетной камере количества эритроцитов.

Источник

Взятие крови и подсчет эритроцитов и лейкоцитов в счетной камере

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Смесители для эритроцитов и лейкоцитов.
2. Пробирки типа серологических.
3. Пипетки на 1 и 5 мл.
4. Капилляры к гемометру Сали.
5. Стеклянные палочки.
6. Глазные пипетки.
7. Счетные камеры Горяева со шлифованными стеклами к ним.
8. Микроскопы.
9. Колбочки с чистой водой.
10. Поваренная соль.
11. Сулема.
12. Сернокислый натрий.
13. Ледяная уксусная кислота.
14. 96° этиловый спирт.
15. Генцианвиолет (метиленовая синька).
16. Набор для взятия крови из пальца.

Взятие крови в смесители для подсчета эритроцитов и лейкоцитов

Для подсчета количества эритроцитов и лейкоцитов необходимы следующие реактивы:

1. 3% раствор хлористого натрия (NaCl) : 3 г хлористого натрия помещают в колбочку на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки 100 мл.
2. Реактив Гайема: к 0,5 г сулемы, 1 г хлористого и 5 г сернокислого натрия приливают 200 мл дистиллированной воды. Оба реактива сохраняют эритроциты.
3. 3% раствор уксусной кислоты — 3 мл ледяной уксусной кислоты помещают в цилиндр на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки. Реактив подкрашивают 1% водным раствором генцианвиолета из расчета 5-6 капель краски на 10 мл 3% уксусной кислоты.

Кровь для подсчета эритроцитов и лейкоцитов берут в специальные смесители или в пробирки.
На чистый и сухой смеситель для эритроцитов надевают резиновую трубочку со стеклянным мундштуком, после чего в него насасывают кровь, без пузырьков воздуха, точно до метки 0,5, затем этим же смесителем набирают 3% раствор хлористого натрия или реактив Гайема точно до метки 101, не допуская появления пузырьков воздуха. При этом кровь разводится в 200 раз. Со смесителя снимают резиновую трубочку, захватывают его между пальцами, несколько раз встряхивают, прокалывают им бумажку, на которой указана фамилия больного, и кладут его на стол в горизонтальном положении.

В чистый сухой смеситель для лейкоцитов таким же способом, как и в смеситель для эритроцитов, насасывают кровь до метки 0,5, после чего тем же смесителем набирают 3% раствор уксусной кислоты до метки 11. При этом кровь разводится в 20 раз. Затем со смесителя снимают резиновую трубочку, несколько раз встряхивают его, прокалывают им бумажку, на которой указана фамилия больного, и кладут на стол в горизонтальном положении.

Взятие крови в пробирки для подсчета эритроцитов и лейкоцитов по Н. М. Николаеву

Для каждого взятия крови берут две нумерованные пробирки, серологическую и агглютинационную. В серологическую пробирку помещают 4 мл 3% раствора хлористого натрия или реактива Гайема, а в агглютинационную — 0,4 мл 3 % раствора уксусной кислоты. В каждую пробирку вносят по 0,02 мл крови, взятой капилляром от гемометра, и тотчас же смешивают содержимое пробирок, вращая их между ладонями.

В серологической пробирке (для эритроцитов) получают разведение крови в 200 раз, а в агглютинационной (для лейкоцитов) — в 20 раз.

Изучение счетной камеры Горяева и заполнение ее кровью для подсчета эритроцитов и лейкоцитов

Количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывают в специальных счетных камерах. Для этой цели пользуются счетной камерой Горяева, которая представляет собой стекло с нанесенными на него двумя сетками. Сетки отделены одна от другой углублениями и делятся разграничительными линиями на 225 квадратов. Площадь сетки 9 мм2, высота, создающаяся при притирании шлифованного покровного стекла в камере, 0,1 мм, объем 0,9 мм3. Перед заполнением камеры кровью ее моют водой и насухо вытирают.

К сухой поверхности камеры притирают шлифованное покровное стекло, плавно продвигая его по ней взад и вперед до появления цветных колец Ньютона в местах соприкосновения покровного стекла со стеклом камеры. Затем кровь в смесителе встряхивают в течение 1-2 минут, после чего из смесителя выпускают на ватку 1-2 капли крови, следующую каплю помещают перед шлифованным покровным стеклом. При нанесении капли крови надо следить за тем, чтобы в пространство над сеткой камеры не попал воздух и чтобы не было избытка жидкости. Одну сетку заполняют для подсчета эритроцитов, вторую — для подсчета лейкоцитов.

Для заполнения камеры Горяева кровью, взятой по способу Н. М. Николаева (пробирочный метод), поступают следующим образом. К счетной камере притирают шлифованное стекло. Из каждой пробирки, предварительно встряхнув ее, с помощью стеклянной палочки с оплавленным концом берут по одной капле жидкости и заполняют ими раздельно обе сетки камеры, для чего каплю помещают перед щелью, образующейся между шлифованным стеклом и счетной камерой, в результате чего жидкость заполняет пространство над сетками.

Подсчёт эритроцитов и лейкоцитов в счетной камере Горяева

Количество эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева подсчитывают с помощью микроскопа. Для этого заполненную разведенной кровью камеру Горяева помещают на предметный столик микроскопа и под малым увеличением (окуляр 15 X или 10Х, объектив 8Х), с опущенным конденсором находят сетку камеры. К подсчету форменных элементов приступают через 2-3 минуты после заполнения камеры кровью.

Эритроциты подсчитывают в пяти квадратах, каждый из которых разделен на 16 маленьких квадратиков. Подсчет начинают с левого верхнего квадрата, а затем продвигают камеру по диагонали сверху вниз. Во избежание повторного подсчета одних и тех же эритроцитов руководствуются следующим правилом: все эритроциты внутри квадратика и на разграничительных линиях подсчитывают только тогда, когда они большей своей половиной заходят внутрь квадратика; клетки, пересеченные разграничительной чертой пополам, подсчитывают лишь на двух сторонах из четырех сторон квадрата (на левой и верхней); клетки, выходящие большей своей половиной за пределы разграничительных линий, совсем не считают.
Результаты подсчета эритроцитов по каждому из пяти больших квадратов записывают и суммируют. Для расчета количества эритроцитов пользуются следующей формулой:

где х — количество эритроцитов в 1 мм3 крови; а — сумма эритроцитов, подсчитанных в пяти квадратах; б — разведение крови в 200 раз; в — количество сосчитанных маленьких квадратиков — 80.

Для упрощения расчета к количеству подсчитанных эритроцитов приписывают четыре нуля.
В норме количество эритроцитов от 4 500 000 до 5 000 000 в 1 мм3 крови.

Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах. При подсчете их руководствуются теми же правилами, которые указаны для эритроцитов, а затем производят расчет по приведенной выше формуле, в которой цифра разведения равна 20, а количество подсчитанных квадратов — 1600.
Для простоты расчета количество подсчитанных лейкоцитов умножают на 50 или делят на 2 и приписывают два пуля.
В норме количество лейкоцитов от 5000 до 8000 в 1 мм3 крови.

Чистка смесителей. После подсчета лейкоцитов смесители моют следующим образом: резиновой грушей удаляют остатки крови, после чего их многократно промывают дистиллированной водой, спиртом и просушивают эфиром или в сушильном шкафу. Показателем чистоты смесителей служит свободное передвижение бусинки при встряхивании смесителя.

В последнее время для подсчета эритроцитов и лейкоцитов пользуются целоскопом отечественного производства СФЭК-62, который позволяет быстро и точно определить количество форменных элементов в 1 мм3 крови.
Техника его использования подробно изложена в инструкции, приложенной к прибору.

Вычисление цветного показателя (цветной коэффициент)

Цветной показатель выражает среднее содержание гемоглобина в одном эритроците. В норме цветной коэффициент равняется 1,0 при 100% гемоглобина и 5 000 000 эритроцитов в 1 мм3 крови. Его рассчитывают исходя из следующей пропорции: найденное количество гемоглобина (в единицах) так относится к его нормальному количеству, как найденное количество эритроцитов к их нормальному числу.

Например, если найденный гемоглобин равен 88 ед., а количество эритроцитов 4 8000 000 в 1 мм3, то цветной показатель равен 0,91.

Практически легче рассчитать цветной показатель упрощенным способом: путем умножения найденного количества гемоглобина на 5 и деления полученного произведения на первые три цифры подсчитанных эритроцитов.

При количестве эритроцитов меньше 1 000 000 делить надо на две первые цифры подсчитанного числа эритроцитов. Цветной показатель в норме равен 0,9-1,1.

Определение содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ)

В последнее время наряду с цветным показателем рассчитывают более достоверную абсолютную величину — содержание гемоглобина в одном эритроците — СГЭ. При расчете этого показателя весовое количество гемоглобина выражают в очень мелких единицах — микромикрограммах (мкмкг), или, что правильнее — пикограммах (пг).
СГЭ получают умножением количества гемоглобина в грамм-процентах на 10 и делением на число эритроцитов в миллионах.

Источник

Как приготовить уксусную кислоту для подсчета лейкоцитов

Принцип прямого счисления заключается в следующем: разбавить кровь в пипетке Potain (предусмотренной красным шариком для эритроцитов и белым — для лейкоцитов и тромбоцитов), при этом разбавляющая жидкость разная, соответственно виду клеток.

К разбавляющим жидкостям относятся:
а) для эритроцитов:
— хлорид натрия —1 г.
— сульфат натрия — 5 г.
— сублимат — 0,5 г.
— дистилированная вода — 200 мл.

б) для лейкоцитов:
— ледяная укусусная кислота — 2 мл.
— 1% метиленблау — 1 капля
— дистилированная вода — до 100 мл.

в) для тромбоцитов: — щавелевокислый аммоний — 1 г.
— Nа₂ЭДТА — 0,01 г.
— дистилированная вода — 100 мл.

Пипетки Potain должны быть чистыми, совершенно сухими и цельными. До потребления пипетку испытать на проницаемость путем вдувания воздуха, после использования ее следует промыть проточной водой, с помощью трубки для вакуума, затем дистилированной водой. Через несколько дневные интервалы держать пипетку по 24 часа в серохроми-стой смеси, затем промывать тщательно проточной и дистилированной водой.

Высушивать в сушильном шкафу, при температуре 180°. Когда требуется срочное высушивание, пипетку промывать спиртом, а затем эфиром.

Разжижение крови. Набрать в пипетку кровь до деления 0,5, затем разбавляющую жидкость до деления 101 — в пипетку с красным шариком (для счисления эритроцитов) и до деления 11 в пипетку с белым шариком (для счисления лейкоцитов и тромбоцитов). Получаются следующие растворы: 1/200 для эритроцитов и 1/20 для лейкоцитов и тромбоцитов.

Счисление проводится в камере Бюркер-Тюрк или Горяева, к которой хорошо прикреплена чистая оригинальная пластинка.

Заполнение камеры для счисления. В течение 2 мин. хорошо встряхивать пипетку, затем отбросив первые 2—3 капли налить в камеру для счисления, на край пластинки, небольшое количество смеси, которое заполнит пространство в силу капиллярности. Нежелателен избыток смеси, поскольку он заполняет канавки гемоцитометра. Подождать выпадение форменных элементов крови (1—2 мин. в случае эритроцитов и лейкоцитов, 10—15 мин. во влажной камере — для тромбоцитов).

Счисление эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Исследование проводить обычным оптическим устройством (объективом 10 х для лейкоцитов и 20 х или 40 х для эритроцитов и тромбоцитов, при этом конденсор располагается в среднем положении). Счисление проводить на следующих площадях;
— для эритроцитов — 5 квадратов (1/25 квадратиков по 1/400), т.е. 1/5 мм 2 ;
— для лейкоцитов — 4 квадрата, расположенные по углам камеры Бюркер-Тюрк, т.е. 4 мм 2 ;
— для тромбоцитов — одинаково с эритроцитами.

Из клеточных элементов, расположенных по линиям, отграничивающим площади счисления, подсчитывать лишь те из них, которые находятся вдоль одной вертикальной отграничивающей линии (напр. левой) и одной горизонтальной (напр. верхней).

Расчет эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. В целях определения числа форменных элементов на мм 2 учитывать площадь, вышину, разведение:
№ эритроцитов/мм 3 = № насчитанных эритроцитов х 5 х 10 х х 200 = № эритроцитов х 10 000;
№ лейкоцитов/мм 3 = № насчитанных лейкоцитов х 10 х 20 : 4 = = № насчитанных лейкоцитов х 50;
№ тромбоцитов/мм 3 = № насчитанных тромбоцитов х 5 х 10 х х 20 = число насчитанных тромбоцитов х 1000.

Отбор крови для подсчета тромбоцитов можно проводить также пипеткой Potain для эритроцитов, в таком случае отсасывать кровь до деления 1 а разбавляющую жидкость до деления 101. Получится разведение 1/100. Тромбоциты счислять с 200 квадратиков (1/2 мм2), полученную цифру умножить на 2000.

Поправка числа лейкоцитов в случае эритробластоза. Когда в крови находятся эритробласты число ядерных элементов, полученных при счислении, откоррегировать соответственно результату лейкоцитной формулы, по формуле: № лейкоцитов/мм3 = № ядерных элементов/мм3 х 100 / (100 + № эритробластов/100 лейкоцитов).

Количественное определение кровяных клеток основывается на их счислении на небольшом, предполагаемым однородным образце и обобщением результата на всю массу крови организма. Между полученным результатом и фактическим значением может возникнуть разница (погрешность), которая подвергается математическому расчету для определения степени точности каждого метода в отдельности.

Отклонения от строгого соблюдения технических указаний создают многочисленные причины погрешностей на протяжении всего процесса производимых в камере подсчетов. В том числе:
а) погрешности отбора,
б) ошибки аппаратуры,
в) техники,
г) неоднородного распределения в счислительной камере.

Когда проба отбирается одной пипеткой а счисление производится в одной камере погрешность определения числа эритроцитов составляет ±30%, лейкоцитов +20%, а тромбоцитов +30—40%. В то время как в отношении лейкоцитов и тромбоцитов такая погрешность незначительна, поскольку она меньше биологических колебаний, в отношении эритроцитов точность техники представляется неудовлетворительной.

В целях максимального снижения погрешности — и повышения точности счислений попимо строгого соблюдения технических указаний, пробы следует отбирать в 2 пипетки, а счисление проводить в 2 гемоцитометрах. В таких условиях наименьшая погрешность для эритроцитов уменьшается до +11%, для лейкоцитов и тромбоцитов до +16%. Однако электронное счисление представляет значительно большую степень точности. Так в отношении эритроцитов погрешность составляет +3%, для лейкоцитов+4%, а в отношении тромбоцитов +7,5%.

Тем не менее, счисление эритроцитов в камере остается наиболее сложный и в то же время наименее точный метод, причины, по которой его нельзя рассматривать как метод отбора. Единственным показанием к счислению эритроцитов является определение вида анемии.

При счислении тромбоцитов, независимо от метода, для проверки точности результата делается сопоставление с аспектом тромбоцитов на мазке крови.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Источник