Как приготовить забуференную воду

Приготовление забуференного изотонического раствора NaCl

Используя маточные растворы фосфатов можно приготовить изотонический раствор с диапазоном рН от 5,3 до 8,0. Для этого готовят буферную составляющую в объеме 100 мл (см.таблицу выше), которую далее смешивают с 900 мл изотонического раствора. После этого проводят контроль рН. Если значения последнего отличаются от требуемых, то добавляют натриевую соль, обладающую ощелачивающим действием (если требуется повысить значение рН) или калиевую (если необходимы более низкие значения ) для легкого подкисления. Если необходимо приготовить меньшие количества забуференного изотонического раствора, к примеру всего 100 мл, то количество объемов составляющих пропорционально уменьшают в требуемое число раз (для приготовления 100 мл раствора 90 мл физиологического раствора смешивают с 10 мл буферной смеси).

Эритроцитарные антигены, удаляемые или разрушаемые ферментами

Когда эритроциты обрабатываются папаином или фицином (вероятно тот же эффект оказывают также хемотрипсин и бромелин), антигены M, N, Fy a , Fy b , Xg a удаляются или разрушаются. При обработке трипсином утрачиваются первые 2 и последний из упомянутых эритроцитарных антигенов. Хотя многие исследователи полагают, что разрушаются также и антигены системы Даффи, в действительности этот эффект обусловлен примесями хемотрипсина, часто присутствующими в препаратах трипсина.

Действие ферментов на другие структуры мембраны эритроцитов не столь однозначное. К примеру, в некоторых публикациях описаны факты, указывающие на сохранение на энзимированных эритроцитах антигена S (фицин, папаин). Практически все исследователи отмечают, что антиген s сохраняется на энзимированных эритроцитах а S сохраняется после обработки трипсином. Однако, в то же время известно, что Ss-сиалогликопротеин, отделенный от эритроцитов, может быть рассечен в различных участках действием трипсина, папаина и фицина. При этом, тем не менее, имеются участки, недоступные для действия ферментов. Таким образом, сохранение указанных антигенов при энзимировании зависит отчасти и от концентрации используемых растворов ферментов и длительности энзимирования.

Антиген En a TS, содержащийся на MN-сиалогликопротеине, разрушается под действием трипсина, фицина и папаина. En a FS, с другой стороны, теряет свою активность под воздействием папаина и фицина, но выдерживает действие трипсина. Эти антигены более детально рассматриваются в главе 14.

Антигены Sp₁, Pr₁, Pr₂ полностью удаляются под действием трипсина, папаина и фицина, из указанной серии удается «уцелеть» лишь антигенной детерминанте Pr a , которая, кстати говоря, выдерживает также и действие нейраминидазы.

Как рассматривается более детально в главах 4 и 17, антигены Чидо и Роджерс [Ch a и Rg a cоответственно], являются составной частью порции C4d C4-компонента комплемента и присоединяющиеся к эритроцитам путем адсорбции. Они могут быть удалены с эритроцитов путем их обработки папаином или фицином. Разумеется, весьма удивительным является тот факт, что трипсин, рассекающий компонент C4b на C4c и C4d, также разрушает указанные антигены.

Имеются 2 сообщения о том, что антиген системы Лютеран Lu a разрушается трипсином и хемотрипсином, иммуногематологи должны принять это во внимание . Кроме того, известно, что эти ферменты в комбинации разрушают также антиген К (система Келл) или если сначала действует один, а затем другой фермент (все равно в какой последовательности).

Несмотря на то, что впервые обнаруженные антитела анти-Yt a (система Картрайт) давали усиленные реакции в непрямом антиглобулиновом тесте с трипсинизированными эритроцитами, было удачно подмечено, что антиген Yt a может быть полностью или частично разрушен папаином.

Заметки о проназе (в России известна как протеаза-С —примечание В.А.)

Хотя этот фермент не применяется в иммуногематологии так же регулярно как другие упомянутые выше, это одна из самых мощных известных протеаз. Известно, что проназа являет собой смесь нескольких компонентов, среди которых есть фракции, которые по своему эффекту напоминают трипсин и хемотрипсин. Judson & Anstee установили, что проназа в концентрации 1 мг/мл разрушает антигены M, N, S, s, Fy a , K но не D. Меньшая концентрация 0,2 мг/мл разрушала все перечисленные антигены кроме K и D.

Примечание Морокова В.А. — в литературе имеются сообщения, что проназа с успехом может применяться для дифференциации антител систем LW [антигены LW a , LW b & LW ab разрушаются проназой] и Rh (указанные антигены сохраняются на эритроцитах, энзимированных проназой).

Ручной тест с полибреном(manual polybrene test)

В течение многих лет полибрен, четвертичный полимер аммония и поливинилпирролидон применялись для ускорения аггрегации эритроцитов и, таким образом, использовались выявления антител в AutoAnalyzer (зарегистрированный торговый знак Technicon Corporation). В 1979 году Richard E.Rosenfield и соавторы внедрили некоторые ручные тесты с использованием поликатиона, протамин-сульфата с целью получить чувствительность тестов, которая приближается к таковой при использовании AutoAnalyzer. В 1980, Lalezari и Jiang описали ручной тест с полибреном, вновь использовав принципы метода, положенного в основу функционирования автоматизированной системы. Метод, описывается ниже в таком виде, каком его описали Lalezari и Jiang в своей первой публикации.

В этом тесте эритроциты инкубируются с сывороткой и растворе LISS в течение одной минуты. Затем добавляется полибрен с целью вызвать аггрегацию эритроцитов. Пробы центрифугируются, надосадочная жидкость полностью удаляется и добавляется глюкозо-цитратный раствор для дезаггрегации эритроцитов. Контакт сыворотки с эритроцитами занимает всего одну минуту, тест может быть полностью выполнен в течение 3-х минут. Следует сказать, что в отношении антител системы Rh данный тест чувствительнее антиглобулинового в 10 — 160 раз. Garratty сообщил, что данный тест является исключительно ценным для скрининга антиген негативных образцов эритроцитов доноров для иммунизированных больных. Используя его можно, к примеру, быстро выявить с- или е-негативных доноров среди большого числа обследуемых. Метод является очень быстрым и весьма экономичным в плане расходования тестовых сывороток, Более того, в полибреновом методе можно с успехом использовать образцы сывороток, которые неактивны при использовании других методов. Некоторые образцы антител системы Кидд, дающие слабые или сомнительные реакции в других методах, демонстрируют резко положительные реакции в полибреновом методе.

В первой публикации, посвященной описанию метода было отмечено, что антитела системы Келл не реагируют достаточно хорошо в полибреновом методе. Соответственно, при работе с этими антителами следует проводить конверсию теста в непрямой антиглобулиновый. При этом следует использовать антиглобулиновый реагент без антикомплементарной фракции анти-С3, поскольку в растворе LISS имеет место интенсивная фиксация компонентов С3 и С4 комплемента на эритроцитах в отсутствие клинически значимых противоэритроцитарных антител.

Необходимые материалы

Раствор низкой ионной силы (LISS)

Растворите 50 г D-глюкозы (декстрозы) и 2 г трилона Б (Na₂EDTA) в 1 литре дистиллированной воды. Храните раствор до использования при 4 о С.

Полибрен (маточный раствор)

Растворите 1 г полибрена в 100 мл 0,9% растворе NaCl. Храните этот раствор в полимерной таре, поскольку стекло адсорбирует полибрен, поэтому может привести к ослаблению свойств полибрена вызывать аггрегацию.

Рабочий раствор полибрена

Разведите 1 объем 1% маточного раствора в 20 объемах изотонического раствора поваренной соли.

Глюкозо-цитратный раствор

Смешайте 60 мл 0,2М раствора натрия цитрата трех замещенного с 40 мл с 40 мл 5%раствора D-глюкозы.

Отмывающий раствор для антиглобулинового теста

Смешайте 50 мл 0,2М раствора натрия цитрата трех замещенного с 950 мл физиологического раствора.

Метод

1.Смешайте в пробирке 0,1 мл (2 капли сыворотки) с достаточным количеством упакованного осадка отмытых эритроцитов, конечная концентрация последних должна составлять приблизительно 0,5% (см.далее замечания).

2.Добавьте 1,0 мл LISS, перемешайте содержимое и оставьте пробы на 1 минуту при комнатной температуре.

3.Добавьте 0,1 мл (2 капли) рабочего раствора полибрена и перемешайте, оставьте пробы на 15 секунд при комнатной температуре.

4.Центрифугируйте пробы при 1000g в течение 10 секунд.

5.Удалите весь супернатант, свободный от эритроцитов, осушите внутренность пробирок.

6.Добавьте 0,1 мл глюкозо-цитратного раствора во все пробирки.

7.Закрепите пробирки под углом 45 о и осторожно встряхивайте их приблизительно в течение 10 секунд до тех пор, пока аггрегация эритроцитов, обусловленная полибреном не разойдется.

8.Учтите результаты по наличию или отсутствию агглютинации и запишите результаты (см. замечания).

9.Для отрицательных результатов, требующих конверсии в антиглобулиновый тест, добавьте в пробирки по 0,05 (1 каплю) глюкозо-цитратного раствора.

10.Тщательно перемешайте содержимое пробирок.

11.Отмойте дважды содержимое пробирок раствором, пропись указана выше.

12.Удалите полностью отмывающий раствор, добавьте АГС, центрифугируйте пробы 15 секунд и осторожно встряхивая последние, учтите результаты. Используйте эритроциты, нагруженные IgG для положительного и отрицательного контролей (более детально см. главу 4).

1.Сообщалось, что концентрация рабочего раствора для разных лотов полибрена может варьировать слегка вокруг цифры 0,05%. Оптимальную концентрацию в этих случаях находят методом проб и ошибок. Метод синтеза полибрена опубликован.

2.В качестве тестируемого материала при скрининге антител и постановке претрансфузионных тестов используют неразведенные сыворотки. Когда проводят поиск антиген негативных образцов эритроцитов, тестовые сыворотки могут быть разведены, чем может быть достигнута большая экономия ценных сывороток. Рекомендуется разводить тестовые сыворотки сывороткой АВ группы, адсорбированной от холодовых агглютининов или, лучше 5% раствором нормальной АВ сыворотки в изотоническом растворе (1 объем сыворотки АВ группы смешивают с 19 объемами изотонического раствора).

3.В первой публикации, описывающей метод, сказано, что при необходимости при учете результата может быть применено микроскопирование.

4.Промедление в учете результата после добавления глюкозо-цитратного раствора может привести к ослаблению выраженности положительных результатов вплоть до исчезновения агглютинации (если это продолжается слишком долго). Рекомендовано, чтобы учет результатов проводился в течение 3 минут с момента добавления глюкозо-цитратного раствора. Тесты не должны подвергаться повторному центрифугированию после добавления глюкозо-цитратного раствора и встряхивания, поскольку это приведет к исчезновению положительных результатов.

5.В первой публикации, описывающей эту технику, рекомендовано двукратное отмывание эритроцитов при конверсии теста в непрямой антиглобулиновый. Без сомнения, найдутся исследователи, которые попробуют поэкспериментировать с количеством отмываний — они легко убедятся в том, что чувствительность теста не снизится и после 3- или 4-х отмываний.

6.Каждую серию тестов рекомендуется проводить, выполняя контрольные положительные и отрицательные тесты. Это необходимо для сопоставления выраженности аггрегации, вызываемой полибреном, ее реверсии после добавления глюкозо-цитратного раствора и встряхивания. Контроли, наконец, позволяют судить о том, как выглядят положительные и отрицательные результаты в полибреновом методе на этапах 8 и 12.

ZZAP обработка эритроцитов

В 1980 году Branch & Petz описали использование раствора, содержащего папаин и дитиотрейтол. Был разработан метод обработки эритроцитов больных с наличием тепловых аутоиммунных противоэритроцитарных антител, позволяющий удалить аутоантитела с эритроцитов. Известно, что такие эритроциты крайне сложно фенотипировать с использованием тест-систем на основе IgG антител, поскольку все они демонстрируют ложноположительные реакции. Было показано, что такая обработка эритроцитов приводит к разрушению антигенов M, N, Fy a, Fy b и всех антигенов системы Келл. Таким образом, могут быть искусственно получены эритроциты фенотипа Ко («Келл-нуль»).

Приготовление раствора ZZAP

1.Приготовьте 0,2 М раствор дитиотрейтола растворив 1 г сухого вещества в 32,4 мл забуференного до 7,3 изотонического раствора.

2.К 2,5 мл приготовленного 0,2 М раствора дитиотрейтола добавьте 0,5 мл 1% раствора активированного папаина (приготовленного по Low как описано выше) и 2,0 мл изотонического раствора, забуференного до 7,3. Тщательно перемешайте путем перевертывания. Конечный раствор должен иметь рН между 6,0 и 7,0, может храниться при 4 о С в течение 24 часов.

Обработка эритроцитов

1.Упакуйте обрабатываемые эритроциты путем жесткого центрифугирования и отделения супернатанта. В отмывании их нет необходимости.

2.К каждому 1 мл упакованных эритроцитов добавьте по 2 мл раствора ZZAP.

3.Перемешайте содержимое пробирок и инкубируйте их при 37 о С в течение 30 минут.

4.Отмойте 3 раза изотоническим раствором и используйте для аутоадсорбции или в других серологических тестах.

Источник

ГК «Униконс»

Продвижение и реализация комплексных пищевых добавок, антисептиков и др. продукции.

«Антисептики Септоцил»

Септоцил. Бытовая химия, антисептики.

«Петритест»

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

«АльтерСтарт»

Закваски, стартовые культуры. Изготовление любых заквасок для любых целей.

• Вы здесь:
• Библиотека технолога
• ГОСТы, документы
• ГОСТ 31659-2012 — Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

Приложение В (обязательное)

Приложение В (обязательное)

Состав и приготовление питательных сред и реактивов

В.1 Забуференная пептонная вода

В. 1.1 Состав:
— пептон — 10,0 г;
— хлористый натрий — 5,0 г;
— двузамещенный фосфорнокислый натрий 12-водный (Na2HPО4 • 12Н2О) — 9,0 г;
— однозамещенный фосфорнокислый калий (КН2РО4) — 1,5 г;
— вода — 1000 см3.

В.1.2 Приготовление
При нагревании компоненты растворяют в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 ± 0,2) при температуре 25 °С. Среду разливают во флаконы подходящей вместимости с учетом добав¬ления необходимой навески продукта. Если навеска равна 25 г, то забуференную пептонную воду разливают по 225 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ± 1) °С.

В.2 Среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон)
В.2.1 Раствор А
В.2.1.1 Состав:
— ферментативный гидролизат сои — 5,0 г;
— хлористый натрий — 8,0 г;
— фосфорнокислый однозамещенный калий (КН2РО4) -1,4 г;
— фосфорнокислый двузамещенный калий (К2НРО4) — 0,2 г;
— вода — см3.
В.2.1.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании до температуры около 70 °С. Раствор готовят за день до приготовления RVS-бульона.

В.2.2 Раствор В
В.2.2.1 Состав:
— хлористый магний 6-водный (MgCI2 ∙ 6Н2О) — 400 г;
— вода — 1000 см3.
В.2.2.2 Приготовление
Хлористый магний растворяют в воде. Поскольку эта соль очень гигроскопична, рекомендуется из новой открытой упаковки растворять ее по определенной схеме. Например, к 250 г хлористого магния 6-водного добавляют 625 см3 воды, получая раствор объемом 788 см3 массовой концентрации 31,7 г/100 см3. Состав раствора соответствует В.2.2.1. Раствор переносят в бутылку из темного стекла с притертой пробкой и хранят при комнатной темпе-ратуре не более двух лет.

В.2.3 Раствор С
В.2.3.1 Состав:
— малахитовый зеленый оксалат — 0,4 г;
— вода — 100 см3.
В.2.3.2 Приготовление
Малахитовый зеленый оксалат переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Раствор переносят в бутылку из темно¬го стекла, хранят при комнатной температуре не более 8 мес.

В.2.4 Готовая среда
В.2.4.1 Состав:
— раствор А (см. В.2.1) — 1000 см3;
— раствор В (см. В.2.2) — 100 см3;
— раствор С (см. В.2.3) — 10 см3.
В.2.4.2 Приготовление
Прибавляют к 1000 см3 раствора А 100 см3 раствора В и 10 см3 раствора С. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (5,2 ± 0,2). Перед использованием среду разливают по пробиркам по 10 см3. Сте¬рилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (115 ± 1) °С. Рекомендуется использовать среду в день приготовления. При необходимости допускается готовую среду хранить по ГОСТ 10444.1.
Следует учитывать, что на этой среде не растет S. Typhi.
Примечание — Конечный состав среды: ферментативный гидролизат сои – 4,5 г/дм3; хлористый натрий – 7,2 г/дм3; фосфорнокислый однозамещенный калий – 1,26 г/дм3, фосфорнокислый двузамещенный калий – 0,18 г/дм3; хлористый магний безводный – 13,4 г/дм3 или хлористый магний 6-водный – 28,6 г/дм3; малахитовый зеленый оксалат – 0,036 г/дм3.

В.3 Селенитовая среда
Селенитовую среду готовят из двух растворов.
В.3.1 Раствор 1
В. 3.1.1 Состав:
— пептон – 5,0 г;
— двузамещенный фосфорнокислый натрий безводный – 7,0 г;
— однозамещенный фосфорнокислый натрий – 3,0 г;
— лактоза – 4,0 г;
— вода – 1000 см3.

В.3.1.2 Приготовление
При нагревании растворяют компоненты в воде. Путем изменения соотношения фосфатных солей устанавливают рН (7,0 ± 0,1). Среду разливают по 100 см3 в колбы или флаконы и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение двух дней или при температуре (112 ± 1) °С в течение 30 мин.

В.3.2 Раствор 2
В. 3.2.1 Состав:
— кислый селенистокислый натрий (NaHSeO3) — 10,0 г;
— вода — 100 см3.
Кислый селенистокислый натрий растворяют с соблюдением правил асептики в стерильной дистиллированной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

В.3.3 Готовая среда
В.3.3.1 Состав:
раствор 1 – 100 см3:
раствор 2-4 см3.
В.3.3.2 Приготовление среды
К раствору 1 прибавляют раствор 2, среду разливают по 10 см3 в пробирки.
Стерилизация приготовленной среды не допускается, так как при этом происходит редукция кислого селенистокислого натрия, выпадает осадок красного цвета и среда становится непригодной для использования.
Селенитовую среду выпускают в сухом виде и готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.4 Тетратионатный бульон Мюллер-Кауфман
В.4.1 Основа среды
В. 4.1.1 Состав:
— мясо-пептонный бульон — 100 см3:
— углекислый кальций — 4,5 г.

В.4.1.2 Приготовление среды
В мясо-пептонный бульон, приготовленный по ГОСТ 10444.1, помещают стерильный углекислый кальций. Углекислый кальций стерилизуют по ГОСТ 10444.1.
Приготовленную основу стерилизуют в автоклаве при температуре (121 ± 1)°С в течение 20 мин.

В.4.2 Раствор 1
В. 4.2.1 Состав:
— гипосульфит натрия (Na2S2О3 ∙ 5Н2О) – 50 г;
— вода — до 100 см3.
В.4.2.2 Приготовление
Гипосульфит натрия помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор переливают в колбу или флакон и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или при температуре (121 ±1) °С в течение 20 мин. Раствор хранят не более 1 мес при температуре (3 ± 2) °С.

В.4.3 Раствор 2
В. 4.3.1 Состав:
— йодистый калий – 25 г;
— йод кристаллический – 20 г;
— вода — до 100 см3.
В.4.3.2 Приготовление
Йодистый калий помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, прибавляют кристаллический йод, растворяют его. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят при комнатной температуре в плотно закрытом сосуде из темного стекла.

В.4.4 Раствор 3
В.4.4.1 Состав:
— бриллиантовый зеленый – 0,5 г;
— вода – 100 см3.
В.4.4.2 Приготовление
Бриллиантовый зеленый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

В.4.5 Раствор 4
В.4.5.1 Состав:
— сухая бычья желчь – 10 г
— вода – до 100 см3.
В.4.5.2 Приготовление
Сухую желчь растворяют в 100 см3 дистиллированной воды или используют 100 см3 натуральной желчи. Раствор желчи или натуральную желчь стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение 20 мин. Раствор хранят не более 1 мес при температуре (3 ± 2) °С.

В.4.6 Готовая среда
В.4.6.1 Состав:
— основа среды по В.4.1 – 100 см3:
— раствор 1 – 1 0 см3:
— раствор 2 – 2 см3;
— раствор 3 – 0,2 см3:
— раствор 4 – 5 см3.
В.4.6.2 Приготовление
Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления, среду разливают по 10 см3 в пробирки.
Среду используют в день приготовления.
Для повышения селективности среды допускается добавлять к среде раствор новобиоцина натриевой соли из расчета 0,5 см3 раствора новобиоцина натриевой соли на 100 см3 основы среды.

В.4.7 Раствор новобиоцина
В.4.7.1 Состав:
— новобиоцин натриевая соль – 0,04 г;
— вода – 5 см3.
В.4.7.2 Приготовление
Новобиоцин натриевую соль растворяют в дистиллированной воде. Раствор стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 через мембранный фильтр размером пор 0,22 мкм, хранят при температуре (3 ± 2) °С в течение четырех недель.

В.5 Ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (ХLD-агар)
В.5.1 Основа среды
8.5.1.1 Состав:
— дрожжевой экстракт (порошок) – 3,0 г;
— хлористый натрий (NаС1) – 5,0 г;
— ксилоза – 3,75 г;
— лактоза – 7,5 г;
— сахароза – 7,5 г;
— L-лизин гидрохлорид – 5,0 г;
— тиосульфат натрия – 6,8 г;
— железо III аммоний цитрат – 0 ,8 г;
— феноловый красный – 0,08 г (или 20 см3 раствора, приготовленного по 5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
— деоксихолат натрия – 1,0 г;
— агар – от 9 до 18 г*;
— вода – 1000 см3.
* Зависит от желирующих свойств.
В.5.1.2 Приготовление
При нагревании растворяют дегидратированные компоненты основы или дегидратированную основу в воде при частом помешивании. Доводят до кипения, но не кипятят, избегая перегрева.
Устанавливают рН так, чтобы после прогрева он составлял (7,4 ± 0,2) при температуре 25 °С. Разливают основу в пробирки или флаконы подходящей вместимости. Затем прогревают на кипящей водяной бане около 5 мин.

В.5.2 Раствор фенолового красного
В.5.2.1 Состав:
— феноловый красный – 0,4 г;
— вода – 100 см3.
В.5.2.2 Приготовление
Феноловый красный переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре.
В.5.3 Приготовление чашек со средой
Среду после прогрева переносят в водяную баню при температуре от 44 °С до 47 °С, перемешивают и разливают в чашки, дают затвердеть. Перед использованием среду в чашках предпочтительно с открытой крышкой и поверхностью среды вниз подсушивают в шкафу с температурой от 37 °С до 55 °С до тех пор, пока поверхность среды не станет сухой. Допускается хранить чашки со средой при температуре (3 ± 2) °С не более пяти дней.

В.6 Дифференциально-диагностические среды
В.6.1 Висмут-сульфит агар (агар Вильсон-Блера).
В. 6.2 Среда Плоскирева.
В.6.3 Среда Эндо.
В.6.4 Среда Левина.
Среды готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.6.5 Бриллиантовый зеленый агар
В. 6.5.1 Состав:
— дрожжевой экстракт – 3 г:
— пептон – 10 г;
— хлористый натрий – 5 г;
— лактоза – 10 г;
— сахароза – 10 г;
— феноловый красный – 0,08 г (или 20 см3 раствора, приготовленного по В. 5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
— агар – 20 г;
— бриллиантовый зеленый — 0,0125 г (или 2,5 см3 раствора, приготовленного по В.4.4);
— вода – 1000 см3.
В.6.5.2 Приготовление
При нагревании растворяют дегидратированные компоненты основы или дегидратированную основу в воде при частом помешивании. Доводят до кипения, кипятят 1 мин.
Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 ± 0,1) при температуре 25 °С. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ± 1) С. Охлаждают до температуры от 45 °С до 50 °С и разливают в чашки Петри.

В.7 Питательный агар
В.7.1 Состав:
— мясной экстракт – 3 г;
— пептон – 5 г;
— агар – от 9 до 18 г;
— вода – 1000 см3.
В.7.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,4 ± 0,2) при температуре 25 °С. Переносят питательную среду в пробирки или флаконы, стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ±1) °С.
В.7.3 Приготовление чашек с питательным агаром
Переносят приблизительно 15 см3 расплавленной среды в стерильные чашки Петри и поступают по В.5.3.

В.8 Мясо-пептонный агар
Мясо-пептонный агар готовят по ГОСТ 10444.1 или используют ГРМ-агар. ГРМ-агар готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.9 Мясо-пептонный бульон с глюкозой
Мясо-пептонный бульон с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 см3.

В.10 Среды с углеводами (среды Гисса)
Среды с углеводами (среды Гисса) готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, которые готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.11 Трехсахарный железистый агар (TSI-arap)
В. 11.1 Состав:
— мясной экстракт – 3,0 г;
— дрожжевой экстракт – 3,0 г;
— пептон – 20,0 г;
— хлористый натрий (NaCl) – 5,0 г;
— лактоза – 10,0 г;
— сахароза – 10,0 г;
— глюкоза – 1,0 г;
— железо (III) цитрат – 0,3 г;
— тиосульфат натрия – 0,3 г;
— феноловый красный – 0,024 г (или 6 см3 раствора, приготовленного по В.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
— агар – от 9 до 18 г;
— вода – 1000 см3.
В.11.2 Приготовление
При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,4 ± 0,2) при температуре 25 °С. Переносят среду в пробирки по 7-8 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при (121 ± 1) °С. Затем пробирки оставляют в наклонном положении так, чтобы высота столбика среды составляла около 2,5 см, а скошенная поверхность над ним – 5 см.
Допускается использование агара Клиглера или среды Олькеницкого. Среды готовят по инструкциям, указанным на этикетках.

В.12 Агар с мочевиной (агар Кристенсена)
В 12.1 Основа среды
В.12.1.1 Состав:
— пептон – 1,0 г;
— глюкоза – 1,0 г;
— хлористый натрий (NaCl) – 5,0 г;
— однозамещенный фосфорнокислый калий (КН2РО4) – 2,0 г;
— феноловый красный — 0,012 г (или 3 см3 раствора, приготовленного по В.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
— агар – от 9 до 18 г;
— вода – 1000 см3.
В.12.1.2 Приготовление
При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (6,8 ± 0,2) при температуре 25 °С. Основу среды в определенных объемах разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре (121 ±1) °С в течение 15 мин.

В.12.2 Раствор мочевины
В. 12.2.1 Состав:
— мочевина – 40 г;
— вода до конечного объема – 100 см3.
В.12.2.2 Приготовление
Мочевину помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в воде, объем раствора доводят водой до метки. Раствор мочевины стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 через фильтры с размером пор 0,22 мкм или текучим паром в течение 30 мин.

В.12.3 Раствор фенолового красного
В.12.3.1 Состав и приготовление — по В.5.2.
В.12.4 Готовая среда
В.12.4.1 Состав:
— основа (см. В.12.1) – 950 см3;
— раствор мочевины (см. В.12.2) – 50 см3.
В.12.4.2 Приготовление
Прибавляют с соблюдением правил асептики раствор мочевины к основе, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры от 44 °С до 47 °С. Разливают готовую среду в стерильные пробирки 7-8 см3. После стерилизации среду скашивают по В.11.2.

В.13 L-лизиндекарбоксилазная среда
В.13.1 Состав:
— L-лизин моногидрохпорид – 5,0 г;
— дрожжевой экстракт – 3,0 г;
— глюкоза – 1,0 г;
— бромкрезоловый пурпуровый – 0,015 г (или 5 см3 раствора, приготовленного по В.13.3);
— вода – 1000 см3.
В.13.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании.
Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (6,8 ±0,2) при температуре 25 °С.
Переносят среду в пробирки по 2-5 см3.
Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ±1) °С.

В.13.3 Раствор бромкрезолового пурпурового
В. 13.3.1 Состав:
— бромкрезоловый пурпуровый – 0,3 г;
— вода – 100 см3.
В.13.3.2 Приготовление
Бромкрезоловый пурпуровый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

В.14 β-галактозидазный реактив
8.14.1 Буферный раствор
В. 14.1.1 Состав:
— фосфорнокислый однозамещенный натрий (NaH2PО4) — 6,9 г;
— гидроксид натрия (NaOH) концентрации 10 моль/дм3 — около 3 см3;
— вода до конечного объема — 50 см3.
В.14.1.2 Приготовление
Растворяют фосфорнокислый однозамещенный натрий приблизительно в 45 см3 воды в мерном флаконе. Устанавливают рН с помощью раствора гидроксида натрия (7,0±0,2) при температуре 25 °С. Добавляют воду до объема 50 см3.

В.14.2 ONPG-раствор
В. 14.2.1 Состав:
— о-нитрофенил β-D-галактопиранозид (ONPG) — 0,08 г;
— вода – 15 см3.
В.14.2.2 Приготовление
Растворяют ONPG в воде температурой около 50 °С. Раствор охлаждают.

В.14.3 Готовый реактив
В.14.3.1 Состав:
— буферный раствор (см. В.14.1) – 5 см3;
— ONPG-раствор (см. В. 14.2) – 15 см3.
В.14.3.2 Приготовление
Готовят свежий раствор, прибавляя буферный раствор к ONPG-раствору.

В.15 Среда и реактивы для реакции Фогес-Проскауера (VP)
В.15.1 VP-среда
В. 15.1.1 Состав:
— пептон — 7 г;
— глюкоза — 5 г;
— фосфорнокислый двузамещенный калий (К2НРО4) — 5 г;
— вода — 1000 см3.
В.15.1.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 ± 0,2) при температуре 25 °С. Среду разливают в пробирки по 3 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ±1) °С.

В.15.2 Раствор креатина (N-амидиносаркозина)
В. 15.2.1 Состав:
— креатин моногидрат — 0,5 г;
— вода — 100 см3.
В.15.2.2 Приготовление
Креатин моногидрат растворяют в воде.

В.15.3 1-нафтол, спиртовой раствор
В.15.3.1 Состав:
— 1-нафтол — 6 г;
— спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья объемной долей 96 % -100 см3.
В.15.3.2 Приготовление
Растворяют 1-нафтол в этаноле.

В.15.4 Раствор гидроксида калия
В. 15.4.1 Состав:
— гидроксид калия (КОН) — 40 г;
вода — 100 см3.
В.15.4.2 Приготовление
Гидроксид калия растворяют в воде.

В.16 Реактивы для индольной реакции
В.16.1 Реактив Ковача
В. 16.1.1 Состав:
— 4-диметиламинобензальдегид – 5 г;
— соляная кислота плотностью ρ = 1,18 г/см3 + 1,19 г/ см3 – 25 см3;
— 2-метилбутан-2-ол (изобутиловый спирт) — 75 см3.
В.16.1.2 Приготовление
Компоненты перемешивают.

В.16.2 Реактив Эрлиха
В. 16.2.1 Состав:
— парадиметиламинобензальдегид – 1 г;
— этиловый спирт объемной долей 96% — 95 см3;
— соляная кислота плотностью ρ = 1,18 г/см3 + 1,19 г/см3 – 80 см3.
В.16.2.2 Приготовление
Компоненты перемешивают.

В.17 Триптон/триптофановая среда
В.17.1 Состав:
— триптон — 10 г;
— хлористый натрий (NаС1) – 5 г;
— DL-триптофан – 1 г;
— вода — 1000 см3.
В.17.2 Приготовление
Компоненты растворяют в горячей воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,5 ± 0,2) при температуре 25 °С. Разливают среду по 5 см3 в пробирки. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при темпе¬ратуре (121±1) °С.

В.18 Бульон Хоттингера
Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 см3.

В.19 Мясо-пептонный бульон с 0,05 % L-триптофана
В. 19.1 Состав:
— L-триптофан – 0,05 г;
— мясо-пептонный бульон — 100 см3.
В.19.2 Приготовление
L-триптофан растворяют в мясо-пептонном бульоне, приготовленном по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6-7 см3 и стерилизуют при температуре (121 ±1) °С в течение 20 мин.

В.20 Полужидкий питательный агар
В.20.1 Состав:
— мясной экстракт – 3,0 г;
— пептон – 5,0 г;
— агар – от 4 до 9 г*;
— вода – 1000 см3.
* Зависит от желирующих свойств.
В.20.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 ± 0,2) при температуре 25 °С. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ± 1) °С.
В.20.3 Приготовление пробирок с агаром
В стерильные пробирки наливают по 6-7 см3 свежеприготовленного агара.

В.21 Полужидкий мясо-пептонный агар
Готовят по ГОСТ 10444.1 также, как мясо-пептонный агар, но при приготовлении добавляют 4,0-9,0 г агара на 1 дм3 мясо-пептонного бульона, перед стерилизацией среду разливают по 6-7 см3 в пробирки.

В.22 Физиологический раствор
В.22.1 Состав:
— хлористый натрий (NаCl) – 8,5 г;
— вода – 1000 см3.
В.22.2 Приготовление
Хлористый натрий растворяют в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 ± 0,2) при температуре 25 °С. Разливают во флаконы подходящей вместимости, стерилизуют в автоклаве при температуре (121 ± 1) °С в течение 15 мин.
Допускается использование готовых и дегидратированных, в том числе хромогенных, питательных сред аналогичного состава и зарегистрированных на территории государств, принявших стандарт.

Источник