Приготовить питательную среду эмс

ГК «Униконс»

Продвижение и реализация комплексных пищевых добавок, антисептиков и др. продукции.

«Антисептики Септоцил»

Септоцил. Бытовая химия, антисептики.

«Петритест»

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

«АльтерСтарт»

Закваски, стартовые культуры. Изготовление любых заквасок для любых целей.

• Вы здесь:
• Библиотека технолога
• Микробиология
• Мармузова Л. В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены производства хлебобулочных и мучных кондитерских изделий

Работа № 7. Приготовление питательных сред для выращивания микроорганизмов

Приборы и посуда: термометр, сахариметр, весы технические с разновесами, деревянная мешалка, эмалированная кастрюля, водяная баня, мерный цилиндр, пробирки.

Материалы и реактивы: крупнодробленый ячменный солод, агар, раствор йода, бульонные мясные кубики, пептон, молоко, хлорид натрия, желчь, глюкоза, кристаллический фиолетовый.

Порядок выполнения работы

1. Приготовление затора.

Приготовить раствор йода. Для этого растворить 1 г йодистого калия в 5 мл воды, к полученному раствору добавить 1 г йода и довести объем смеси дистиллированной водой до 300 мл.

В эмалированную кастрюлю насыпать 1 часть солода, добавить 4 части теплой воды и перемешать. Температура смеси должна быть 50 °С. Поставить кастрюлю на водяную баню при 50 °С и выдерживать в течение 30 мин. Затем подогреть баню, чтобы температура смеси повысилась до 63-65 °С, и выдерживать при этой температуре до прекращения окрашивания раствора при добавлении йодного раствора (йодная проба на содержание крахмала).

Полученный затор разлить в пробирки.

2. Приготовление сусла.

Подготовленный затор профильтровать через полотно. Полученный фильтрат нагреть до кипения и кипятить 5-10 мин. Выпавший при кипячении осадок отфильтровать.

Сусло развести водой до плотности 8-10 % по сахариметру, разлить в сосуды и простерилизовать в автоклаве при 0,05 МПа в течение 30 мин.

3. Приготовление сусло-агара.

К готовому суслу добавить 2% агара, и смесь нагреть до расплавления агара. Затем разлить в пробирки и колбы и простерилизовать.

4. Приготовление мясо-пептонного агара.

5 бульонных мясных кубиков (20 г) растворить в 1 л воды. Добавить 100 г пептона и 2% агара. Агар расплавить, и среду кипятить в течение 30 мин. После кипячения смесь профильтровать через марлю и вату и простерилизовать в течение 10 мин.

5. Приготовление обезжиренного молока.

Молоко процентрифугировать. Удалить сливки. Затем разлить в пробирки по 5 и 10 мл и стерилизовать при температуре 121 °С в течение 10 мин.

6. Приготовление солевых бульонов.

Отмерить 100 мл мясо-пептонного бульона и добавить к нему 6 или 9,5% хлорида натрия. Разлить в пробирки по 5 мл и стерилизовать при температуре 121 °С в течение 20 мин.

7. Приготовление молочно-солевого агара.

Мерным цилиндром отмерить 100 мл 2%-ного стерильного агара, содержащего 6,5 % хлорида натрия. Добавить к нему 10 мл обезжиренного стерильного молока.

8. Приготовление мясо-молочного агара.

Мерным цилиндром отмерить 100 мл стерильного мясо-пептонного агара. Добавить 10 мл обезжиренного стерильного молока.

9. Приготовление физиологического раствора. Отмерить 1 л водопроводной воды. Взять навеску массой 8,5 г хлорида натрия и растворить в воде. Раствор разлить в чистые пробирки диаметром 18-20 мм по 10 мл или в колбы — по 93 мл. Стерилизовать в течение 20 мин.

После стерилизации в пробирках остается около 9 мл физиологического раствора, а в колбах — около 90 мл, т. е. такое количество, которое необходимо для приготовления разведений из посевного материала.

10. Приготовление среды Кесслера.

Отмерить 1 л водопроводной воды, прибавить 10 г пептона и 50 мл желчи. Смесь прокипятить при помешивании в течение 20-30 мин на водяной бане. Затем профильтровать через слой ваты. В полученном фильтрате растворить 2,5 г глюкозы и довести объем до 1 л. рН среды довести до значения 7,4-7,6. Добавить 2 мл 1 %-ного водного раствора кристаллического фиолетового.

Среду разлить в пробирки с поплавками и стерилизовать при давлении 0,01 МПа в течение 10 мин. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Источник

Среда с эозин – метиленовым синим (среда Левина)-ЭМС.

Ориентировочная карта основ действий

Практического занятия № 7.

Тема: «Основы приготовления простых и сложных питательных сред»

План:

1. Требования, предъявляемые к питательным средам.

2. Основы приготовления питательных сред.

3. Классификация сред и этапы их приготовления.

4. Приготовление простых сред: МПА, МПБ, полужидкого агара, бульона и агара Хоттингера.

5. Приготовление сложных питательных сред:

— сред сахарного ряда,

— дифференциально-диагностических сред для культивирования энтеробактерий

6. Режимы стерилизации различных сред и контроль качества готовых сред

Самостоятельная работа:

Задание № 1.Ознакомьтесь с инструкцией для проведения практического занятия.

Задание № 2.Изучите требования, предъявляемые к питательным средам.

Основные требования:

1. Питательность —способность содержать основные органогены: С, N, O_2, K, Ca, Mq, Cu, Fe;микроэлементы: Mn, Mo, Zn, CI, Na, Ni и др.

2. Достаточная влажность— не менее 20% воды.

3.Изотоничность (концентрация солей в микробной клетке должна соответствовать концентрации солей в среде).Для большинства микроорганизмов — 0,5%.

4.Оптимальная рН. Диапазон 4,5-8,5. Для большинства патогенных микробов=7,2-7,4.

5. Определенный окислительно — восстановительный потенциал. Еh для анаэробов=0,120-0,060 В, для аэробов= более 0,080 В.

Стерильность.

7.Унифицированность — содержание постоянных количеств определенных веществ: аминного азота 0,8- 1,2 г/л, полипептидов , общего азота-2,5-3,0 г/л, хлоридов-0,5%

Задание № 3. Изучите классификацию сред.

Классификация сред

№	Исходное сырьё	Разновидности	Примеры питательных сред
По исходным компонентам	а) натуральные (готовят из продуктов животного и растительного происхождения) б) синтетические (состоят из химических соединений).	МПБ, МПА, кровяной агар Эндо, Левина, Плоскирева
По консистенции	а) жидкие б) плотные	Селенитовый бульон Свёрнутая сыворотка крови, яйца
По составу	а) простые б) сложные	МПБ, МПА, агар Хоттингера Прибавляют к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и т. д.
По назначению	а) основные (служат для культивирования большинства патогенных микробов) б) специальные (для выделения микробов, не растущих на простых средах) в) элективные (благоприятствуют росту одного микроба, но подавляют рост сопутствующих микроорганизмов). Могут выполнять роль, накопительных сред. г) дифференциально-диагностические (позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности) д) консервирующие (предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала)	МПА, МПБ, пептонная вода Для культивирования стрептококка к среде прибавляют сахар, пневмо- и менонго- кокков — кровь, возбудителей коклюша — кровь. Жёлтые кислоты подавляют рост кишечной палочки, но благоприятны для роста возбудителя брюшного тифа. Глицериновая смесь.

Задание №4. Изучите этапы приготовления питательных сред.

Основные этапы приготовления питательных сред:

1. Изучение инструкции по приготовлению питательной среды.

2. Взятие навески питательной среды и нужного объема дистиллированной воды.

Задание №5. Изучите рецепты приготовления основных сред:

Мясо-пептонный агар (МПА)

38г. порошка размешать в 1 л. дистиллированной воды, довести до кипения, кипятить до полного расплавления агара (1 – 2 мин.). Разлить в стерильные флаконы и стерилизовать автоклавированием в течении 20 мин. при 121°C ( 1 атм.). Перед разливом в чашки Петри среду охладить до 50°C, разливать слоем 4-6 мм. после застывания среды чашки подсушить в термостате при 37°C.

Мясо-пептонный бульон (МПБ)

15г. порошка тщательно размешать в 1 л. холодной дистиллированной воды. Прокипятить 1-2 мин. Не допуская пригорания. Разлить в пробирки и флаконы. Стерилизовать при 120°C 20 мин.

Полужидкий агар

3,8 г. порошка размешать в 1л. дистиллированной воды, довести до кипения, кипятить до полного расплавления агара (1 – 2 мин.). Разлить в стерильные флаконы или пробирки стерилизовать автоклавированием в течении 20 мин. при 121°C (1 атм.). Среду охладить до 50°C, разлить в пробирки по 5 мл.

Бульон Хоттингера.

Перевар Хоттингера разводят водой в 5-6 раз в зависимости от того, какое количество аминного азота онсодержит и какое его количество должно быть в бульоне (указано в паспорте перевара и рецепте среды).

Например, для приготовления среды с 1,2 г/л аминного азота перевар, содержащий 9,0 г/л, надо развести в 7,5 раз (9,0:1,2).

К разведенному перевару прибавляют 0,5% натрия хлорида и кипятят на слабом огне до растворения соли.

В остывшей среде устанавливают рН, фильтруют, разливают и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Агар Хоттингера.

К 1 литру бульона Хоттингера прибавляют 15-25 г. (1,5-2,5%) мелко нарезанного агар-агара. Кипятят, перемешивая, до полного разведения агара. Устанавливают pH — 7,4-7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 120 0 С в течение 20 мин.

Задание №6. Приготовьте питательные среды согласно инструкции.

Задание №7. Изучите рецепты приготовления сложных питательных сред.

Кровяной агар

Расплавить 100 мл. 2% мясопептонного стерильного агара, охладить его до 45°C (не выше!) и прибавить 5 -10 % дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана. Добавление крови производить, соблюдая правила стерильности. Готовую среду разлить в стерильные чашки Петри (предварительно нагретые в термостате). Дать среде застыть и подсушить в термостате.

Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

Сывороточный агар

Расплавить 100 мл. 2% мясопептонного стерильного агара, охладить его до 45°C (не выше!) и прибавить 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки. Добавление сыворотки производить, соблюдая правила стерильности. Тщательно перемешать, избегая образования пены. Разлить в стерильные чашки Петри. Дать среде застыть и подсушить в термостате.

Среды Гисса.

1,5 г. порошка тщательно размешать в колбе с 100 мл. холодной дистиллированной воды, прокипятить 1-2мин., не допуская пригорания, разлить в пробирки по 3-4 мл. Стерилизовать 20 мин. при 110°C (0, 5 атм.) или дробным методом.

Среда Эндо

3,7 4 г. среды размешать в 100 мл. дистиллированной воды, кипятить 2-3 мин. до полного расплавления агара, фильтровать через ватно-марлевый фильтр, снова довести до кипения, охладить до температуры 45-50 °C и разлить в стерильные чашки Петри слоем 5-6 мм. После застывания среды чашки подсушить при температуре 37 °C в течении 40-60 мин. Готовую питательную среду необходимо использовать в день приготовления.

Среда Плоскирева

6,2 г. среды тщательно размешать в 100 мл. дистиллированной воды, кипятить 2- 3 мин., периодически помешивая, до полного расплавления агара. Охладить до температуры 45-50°C и разлить в нестерильные чашки Петри слоем 5-6 мм. и оставить для застывания. Перед посевом чашки со средой подсушить на рабочем столе с открытыми крышками в течении 90-100 мин. при температуре 18 – 25 °C.

Среда с эозин – метиленовым синим (среда Левина)-ЭМС.

3,64 г. среды тщательно размешать в 100 мл. дистиллированной воды, кипятить 2-3 мин. до полного расплавления агара, фильтровать через ватно-марлевый фильтр и автоклавировать при температуре 110°C в течении 20 мин. Стерильную среду охладить до температуры 45 — 50°C и разлить в стерильные чашки Петри слоем 5-6 мм. После застывания среды чашки подсушить при температуре 37 °C в течении 40 – 60 минут.

Источник

7.6. Приготовление питательных сред в лабораторных условиях

Белковой основой всех сред является питательный буль­он; в зависимости от состава среды остальные ингреди­енты добавляют к питательному бульону. Существует два спо­соба приготовления основного питательного бульона: 1) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так на­зываемый мясопептонный бульон; 2) на переварах продук­тов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трип­сина — бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена) или кислоты.

Приготовленные в лабораторных условиях гидролизаты раз­водят до нужного значения аминного азота (от 120 до 200 мг%) и добавляют входящие в рецептуру среды ингредиенты, пред­варительно отвешенные на лабораторных весах.

Растворение. Подготовленные навески ингредиентов поме­щают в стеклянную колбу или кастрюлю, доливают требуемое количество бульона или дистиллированной воды, кипятят на электрической плитке до растворения всех компонентов, уста­навливают необходимое значение рН: сначала с помощью ин­дикаторной бумажки, а затем потенциометра.

Фильтрование. Жидкие питательные среды фильтруют через двойной складчатый фильтр из фильтровальной бумаги, пред­варительно смоченной водой, или через фильтровальное по­лотно, которое накладывают на стеклянную воронку. Полот­няные фильтры значительно практичнее бумажных, так как годны к употреблению в течение длительного времени, в то время как бумажные фильтры употребляются лишь однократ­но. Рекомендуется иметь отдельные полотняные фильтры для каждого вида среды.

Агаровые среды в расплавленном состоянии лучше всего фильтруются через ватно-марлевый фильтр: стеклянную во­ронку покрывают марлевой салфеткой такого размера, чтобы концы салфетки были перекинуты через края воронки наружу; затем на марлю кладут слой гигроскопической ваты, фильтр смачивают горячей дистиллированной водой. Агар наливают на фильтр горячим.

Желатиновую среду фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный дистиллированной водой. Жела­тельно фильтрацию производить быстро в теплом помеще­нии.

Розлив сред. После осветления и фильтрации питательные среды разливают в колбы, флаконы, пробирки, бутыли или матрацы.

Для разливки жидких питательных сред пользуются одной из описанных ниже установок.

• На конец воронки, закрепленной в кольце штатива, наде­вают резиновую трубку, оканчивающуюся стеклянным на­конечником. На резиновую трубку накладывают зажим Мора. Под воронку подставляют сосуд для приема про­фильтрованной среды.
• • Для отмеривания и разливки определенных объемов среды пользуются градуированной бюреткой или собирают специ­альную установку (рис. 7.2). Стеклянную воронку и граду­ированную бюретку соединяют резиновыми трубками с двумя коленами стеклянного тройника, на третье его колено надевают резиновую трубку, заканчивающуюся стеклянным наконечником. На резиновые трубки, соединяющие ворон­ку с тройником, и наконечник накладывают зажимы Мора. Ослабляя первый зажим, наполняют градуированный ци­линдр жидкостью, затем, открыв второй зажим, выпускают отмеренное количество жидкости в сосуд для питательной среды. Первые порции жидкости до вы­теснения воздуха из трубок не учитываются.

При розливе сред края посуды нельзя смачивать питательной сре­дой, так как ватно-марлевые пробки, Приклеиваясь к стеклу во время сте­рилизации, вынимаются с трудом и оставляют в просвете отверстия сосу­да остатки ваты. Попадая в среду, они могут вызывать загрязнение ее посторонней микрофлорой.

Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы с питательными сре­дами надевают бумажные колпачки.

Разливка плотных стерильных пи­тательных сред в чашки Петри. Плот­ную питательную среду (агар, жела­тин) во флаконах или пробирках рас­тапливают в водяной бане (сняв предварительно бумажные колпач­ки). Среду охлаждают до температуры 45–50 °С, сосуд берут в правую руку, левой рукой над огнем вынимают пробку и держат ее между мизинцем и ладонью, а края флакона или пробирки обжигают. Открытую посуду со средой держат в на­клонном положении, чтобы избежать попадания в среду мик­робов из воздуха. В асептических условиях вносят стерильную кровь, сыворотку или другие необходимые добавки, тщательно перемешивают содержимое сосуда. Левой рукой приподнимают с одной стороны крышку чашки Петри и выливают в нее питательную среду в количестве 15–20 мл, слегка покачивая чашку, чтобы среда распределялась равномерным слоем по ее поверхности (рис. 7.3).

В настоящее время ряд фирм изготовляют приборы-авто­маты для разливки агаризованных сред в чашки Петри, обес­печивающие высокую стерильность и точное дозирование разливаемых сред. Один из таких приборов изображен на рис. 7.4.

При застудневании агара образуется большое количество конденсационной воды, которая оседает на внутренней сторо­не крышки и увлажняет поверхность среды. В связи с этим перед посевом среды подсушивают: чашку в открытом виде помещают в термостат таким образом, чтобы крышка служила опорой для края ее дна, перевернутого средой вниз. Чтобы избежать образования конденсированной влаги, чашки с расплавленным агаром тотчас после заливки накрывают листом фильтровальной бумаги, которую стерилизуют вместе с чаш­кой. Бумага не должна касаться поверхности среды. Когда среда окончательно остынет, фильтровальную бумагу снимают, а чашки закрывают крышками.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.

• Синтетические среды и все жидкие и агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре 121 °С.
• Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 110 – 112°С.
• Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыво­ротка крови, асцитическая жидкость или антибиотики и другие добавки), стерилизуют фильтрованием или стериль­ные вещества добавляют в питательные среды ex tempore.

Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мем­бранные фильтры, изготовляемые различными фирмами.

Приготовленные к употреблению стерильные питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термо­стат при температуре 37 °С. Среды, простерилизованные в ав­токлаве, выдерживают в термостате 1 сут, простерилизованные текучим паром – 3 сут.

Источник