Приготовление маточных растворов для питательной среды Мурасиге-Скуга (МС)
Материалы и оборудование:химические стаканы (на 50, 100, 250 мл), мерные цилиндры на 500 мл, автоклав, ламинар-бокс, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг, , колбы, штативы с пробирками, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, хлорамин, стеклянные палочки, электроплитки, магнитные мешалки, дистиллированная вода, вата, 96 % этанол, химические реактивы : KNO3, NH4NO3, NH4H2PO4, MgSO4 . 7H2O, CaCl2 . 2H2O, KH2PO4, MnSO4 . H2O, KI, H3BO3, ZnSO4, CuSO4, Na2MoO4 . 2H2O, CoCl2 . 6H2O, FeSO4 . 7 H2O, Na2ЭДТА , мезоинозит, тиамин- НСl, никотиновая кислота, пиридоксин- НСl, сахароза, ауксины, кинетины, индикаторная бумага, фильтровальная бумага.
Ход выполнения работы:
Маточные растворы солей готовят на дистиллированной воде. Каждую из макросолей растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, а затем сливают в колбу и объем доводят до 1 л, причем раствор MgSO4 . 7H2O вливают последним без нагревания в охлажденную смесь, что предотвращает выпадение осадка. Соль CaCl2 готовят и хранят отдельно. Хелат железа (раствор FeSO4 и Na2ЭДТА) готовят при нагревании и хранят отдельно. Каждую соль микроэлементов растворяют отдельно и сливают в общий стаканчик, а объем доводят до 100 мл. Полученные растворы макро- и микроэлементов сливают в колбы с притертой пробкой (хелат железа – в колбу из темного стекла), наклеивают этикетку и помещают в холодильник.
Для приготовления концентрированных растворов витаминов берут 10-кратные навески и растворяют их (каждый витамин в отдельности) в 10 мл воды; 1 мл содержит концентрацию витамина, необходимую для приготовления 1 л раствора по прописи Мурасиге-Скуга. Хранят растворы во флакончиках из под пенициллина в замороженном состоянии.
Растворы фитогормонов готовят следующим образом. Берут 10 мг вещества и растворяют: ауксин (2,4-Д, ИУК, НУК) в 0,5-2,0 мл этанола; цитокинины (кинетин, зеатин, БАП, 2 ip ) в небольшом количестве 0,5 н НСl или КОН, абсцизовую кислоту (АБК) в 70 %-ном этаноле. Затем растворы подогревают (кроме АБК) и доливают водой до объема 100 мл (1 мл содержит 1 мг гормона). В холодильнике их можно хранить при температуре 4 о С не более 1 мес.
1. Что является основой всех питательных сред для выращивания изолированных клеток и тканей.
2. Какие вещества входят в состав питательных сред и какую функцию они выполняют в культуре клеток и тканей in vitro?
3. Методика приготовления растворов солей питательных сред для культивирования клеткок растений.
4. Цитокинины и ауксины, состав, функции.
5. Витамины, входящие в состав питательных сред.
6. Какие органические добавки вносят в питательную среду?
Лабораторная работа № 4
Приготовление жидкой и агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга
Цель работы: ознакомиться с принципами составления питательных сред для культивирования клеток и тканей in vitro, освоить методику приготовления жидкой и агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга, а также других сред.
Материалы и оборудование:автоклав, ламинар-бокс, весы аналитические до 500 г, химические стаканы (на 50, 100, 250 мл), колбы, мерные цилиндры 500 мл, штативы с пробирками, пипетки от 0,01 мл до 10 мл, хлорамин, стеклянные палочки, электроплитки, дистиллированная вода, 96 % этанол, готовые маточные растворы макро – и микросолей, витаминов, фитогормонов, ауксины, кинетины, индикаторная бумага, фильтровальная бумага.
Теоретические основы
Культивирование изолированных клеток и тканей происходит на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различны по составу, однако, в состав питательных сред обязательно входят следующие, необходимые растениям, группы веществ: микроэлементы, макроэлементы, углеводы, витамины и фитогормоны.
Успех в культивировании клеток, тканей и органов прежде всего определяется составом питательной среды. Культура клеток каждого вида растений и даже разных органов и тканей одного и того же вида требует питательной среды определенного состава. Почти любой исследователь пытается разработать оптимальную среду для своего объекта, поэтому количество рецептов питательных сред с каждым годом все возрастает.
Питательные среды для культивирования содержат минеральные соли, углеводы, витамины, регуляторы роста, аминокислоты.
Выбор питательной среды определяется видом растения, которое вводится в культуру, а также задачами эксперимента. Если, в литературе не имеется необходимой информации, работу начинают с применения таких широко используемых питательных сред, как среда Мурасиге-Скуга, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга В5, Уайта, а затем подбирают концентрации регуляторов роста и органических добавок. В таблице 3 приведены составы некоторых питательных сред. Эти среды оказались эффективными для культивирования in vitro различных видов как однодольных, так и двудольных растений.
Источник
Последовательность и правила приготовления питательных сред
Приступая к приготовлению питательных сред, в частности среды Мурасиге-Скуга (МС), нужно учитывать, что:
1. Минеральные среды готовятся в повышенных концентрациях (обычно 10-20-ти кратных) и могут храниться длительное время, а органические компоненты добавляются непосредственно перед стерилизацией и даже в некоторых случаях уже в стерильную среду (например, спиртовые растворы фитогормонов и термолабильных соединений или стерилизованные фильтрованием растворы аминокислот).
2. При приготовлении исходных концентратов минеральных сред соли кальция растворяются отдельно и добавляются к уже готовым средам. Это необходимо в связи с присутствием в составе сред фосфатов и сульфатов, которые могут образовывать с кальцием малорастворимые соли, выпадающие в осадок при высоких концентрациях исходных компонентов.
3. Некоторые микроэлементы используются в следовых количествах, и их навески трудно отобрать, поэтому их готовят в виде растворов с 1000-кратной или еще более высокой концентрацией. Причем желательно, чтобы соли меди и иодистый калий были разделены, так как при высокой концентрации возможна следующая реакция,
приводящая к потере микроэлементов в виде осадка:
4. В небольшом объеме воды отдельно готовится раствор соли железа и ЭДТА и доводится до кипения для завершения образования хелатного комплекса. Затем раствор прибавляется к концентрату минеральной среды. Таким образом обеспечивается доступность железа для растительных клеток и предотвращается образование малорастворимых солей.
5. После приготовления среды однократной концентрации рН доводится до величины 5,8±0,1 с помощью раствора щелочи. Для большинства учебных задач используются среды, приготовленные на основе минеральной части среды Мурасиге-Скуга (МС), которые отличаются между собой только составом органических компонентов. Среда МС отличается повышенным содержанием элементов питания и полным набором микроэлементов, и обеспечивает максимальную скорость роста для культур большинства видов растений.
Состав среды Мурасиге-Скуга (среда МС) в мг/л:
никотиновая кислота 0,5
аскорбиновая кислота 1,0
Вся работа с культурой тканей in vitro должна проводиться в стерильных условиях. Поэтому все среды, оборудование, материалы и части растений, помещаемые для культивирования на питательные среды, должны быть простерилизованы с помощью методов, приведенных в таблице 1.
Методы стерилизации оборудования и материалов.
| Посуда | Инстру-менты | Материалы | Раститель-ный материал | Рабочее место | Питательная среда |
| 1) Сухим жаром в су-шильном шкафу при 160- 170° 2 часа (кроме мерной посуды). 2) Автокла-вированием при давлении 2 атм., 25-30 минут (в т.ч. мерную посуду). | 1) Обжиганием в пламени спиртовки в ходе работы. 2) Сухим жаром при 140°, 2 .часа 3) Автокла-вированием. 4) Шприци и сверла путем кипячения. | 1) Автокла-вированием при давлении 2 атм., 25-30 мин. (Вата, марля, фильтро-вальная бу-мага, ватные пробки и пр). | 1) Ртутными препаратами: 0.1% сулема (HgCi2) и 0.1% диацид. Семена — 10-15 мин, расту-щие ткани — около 5 мин. 2) 70% спирт, 3) 13-20% Н2О2 4) 3-6% хлорамин 5) 10% гипохлорит натрия | 1) Ламина-рный сте-рильный шкаф. 2) УФ об-лучением. 3) 70% спиртом. 4) Работа в стерильной зоне пламени. | 1) Автокла-вированием при давлении 1 атм (120°), 15-20 мин. 2) Стерили-зационным фильтрованием через фильтры с порами £ 0.45 мкм 3) Дробным кипячением (3 раза с ин-тервалом в сутки). |
Примечания: 1. Для растительного материала применяется только химическая стерилизация. Лучшими стерилизаторами, особенно для нежных растущих тканей, являются препараты ртути, не проникающие в растительные ткани, но требующие отмывки в 4-6 сменах стерильной воды из-за высокой токсичности. 2. 70% спирт даже превосходит по стерилизующей способности 96% и меньше обжигает ткани. Спирт хорошо проникает в ткани растений – время стерилизации листьев 1-2 секунды. 3. Семена стерилизуются дольше – 10-20 минут для всех
стерилизаторов. 4. Холодная стерилизация сред фильтрованием применяется для разлагающихся при нагревании компонентов. Концентрированный стерильный фильтрат вливается в автоклавированный раствор агара.
Цель работы:Приготовление сред для следующих занятий.
Материалы: Пластиковые лодочки для взвешивания, калька, колпачки из фольги для колб или ватно-марлевые пробки; реактивы: неорганические соли, агар-агар, сахароза, гидролизат белка, витамины и фитогормоны.Оборудование. Стаканы химические на 1л, 0.5л по 1шт, на 0.15-0.25л — 4шт., полипропиленовые микропробирки с крышечками на 1.5мл или пенициллиновые флаконы на 10мл — 8-10шт., набор автоматических пипеток (автосамплеров) с диапазоном регулировки 2 – 1000 микролитров, мерные цилиндры на 0.5 и 0.2л. Весы технические и аналитические или торсионные, электроплитка, лабораторный рН-метр.
Ход работы
А. Приготовление минеральной основы среды МС.
Предварительно провести расчеты навесок всех необходимых компонентов среды и занести результаты в таблицу по приведенной ниже форме. В зависимости от массы навески использовать торсионные или технические весы. Все растворы приготовить на дистиллированной воде.
1.Приготовить два концентрированных маточных раствора, содержащих микроэлементы: а) 10мл 100000-кратного раствора, содержащего CuSO4 и СоСl2; б) 10мл 10000-кратного раствора KJ и Na2МоО4.
2. Взвесить соль железа и ЭДТА — из расчета на 5 литров
готовой однократной среды. Растворить навески в 50 мл воды в маленьком стаканчике и довести до кипения на электроплитке.
3. Навески остальных микроэлементов и макроэлементов, кроме соли кальция, растворить в большом стакане, добавить комплекс соли железа с ЭДТА и довести объем до 0.5л, получая 10-кратный раствор, который перелить в колбу для дальнейшего хранения.
4. Навеску соли кальция также рассчитать на 5литров готовой среды и растворить ее в 100 мл воды.
| Маточные растворы | Компоненты | Навески | Конечный объем |
| Раствор 1а Раствор 1б Раствор 2 Раствор 3 Раствор 4 | CuSO4 х 5Н2О CoCl2 х 6H2O KJ Na2МоО4 х 2Н20 Na2ЭДТА FeSO4 х 7Н20 KNO3 NH4NO3 MgSO4 х 7Н2О KH2PO4 H3ВО3 MnSO4 х 4Н2О ZnSO4 х 7Н2О CaCl2 х 2Н2O | 10мл 10мл 50мл 500мл с учетом прилитого раствора 2 100мл |
Примечание: Растворы 1а, 1б, 3 и 4 хранятся длительное время.
Б. Приготовление маточных растворов фитогормонов и витаминов.
1. Взвесить микропробирки, добавить в них небольшое количество кристаллического порошка фитогормона и
снова взвесить. По разнице весов расчитать навеску фитогормона, которая должна составлять от 2 до 7 мг, и по ее точному значению вычислить необходимый объем спирта, чтобы конечная концентрация гормона составила 5 мг/мл. После добавления спирта пробирки закрыть и встряхивать до растворения осадка. Спиртовые растворы являются стерильными и их можно добавлять в среду после ее автоклавирования (некоторые гормоны разлагаются при автоклавировании). При отсутствии аналитических весов отобрать по возможности более точно навеску фитогормона на лодочке из кальки с помощью торсионных весов.
2. Для питательных сред обычно используют аптечные растворы витаминов в ампулах. При их отсутствии приготовить маточные растворы витаминов в микропробирках или пенициллиновых флаконах, растворяя их в воде. Хранить в холодильнике.
В. Приготовление одной из сред, используемых на следующих практических занятиях (по указанию преподавателя).
Согласно прописи состава среды, указанной в тексте соответствующего практического занятия, и необходимого объема среды рассчитать и отобрать навески сахарозы, инозита, пептона и агар-агара.
Агар-агар сразу поместить в колбу, в которой будет проводиться автоклавирование среды, а остальные навески ссыпать в большой стакан. Туда же внести рассчитанные объемы воды, маточных растворов макро- и микроэлементов, и в последнюю очередь добавить раствор CaCl2 при перемешивании.
2. С помощью автоматического дозатора внести рассчитанные аликвоты растворов витаминов и фитогормонов, используя одноразовые наконечники.
3. Довести рН полученного раствора до 5.8±0.1, добавляя при перемешивании раствор щелочи и контролируя рН с
4. Перелить раствор в колбу с навеской агара. Закрыть её ватно-марлевой пробкой или колпачком из фольги и проавтоклавировать 20 мин при 1 атм избыточного давления. После автоклавирования неостывший раствор нужно осторожно перемешать для равномерного распределения содержимого колбы и собравшегося на дне расплавленного агар-агара. Если такой возможности нет, то перед автоклавированием нужно раплавить агар-агар на электроплитке в небольшом количестве раствора и влить его при перемешивании в оставшуюся часть холодного раствора.
Контрольные вопросы:
1.В чем состоят различия органов и клеток растений по потребности в элементах питания в условиях in vitro по сравнению с целым растением? 2. Какие группы веществ входят в состав питательных сред для растительных тканей? 3. Перечислите 5 правил приготовления питательных сред. 4. Как можно стерилизовать растительный материал перед началом его культивирования in vitro? 5. Какие существуют способы стерилизации питательных сред? 6. Как обеспечить стерильность на рабочем месте?
Источник